Toll樣受體4接頭分子對乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的促進(jìn)作用及其機(jī)制

Toll樣受體4接頭分子對乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的促進(jìn)作用及其機(jī)制

陳為,沈楠,韓宛娜,郗艷麗,任曠,金連海,許娜（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥雙創(chuàng)轉(zhuǎn)化實訓(xùn)平臺,吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院低壓低氧環(huán)境與健康干預(yù)創(chuàng)新中心,吉林吉林132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院毒理學(xué)教研室，吉林吉林132013）在哺乳動物體內(nèi)，乳酸是無氧氧化的代謝產(chǎn)物。作為糖類分解的主要代謝途徑之一，無氧氧化的生理功能在于迅速提供能量，對許多生理和病理過程具有重要意義，如劇烈運動的肌纖維供能、傷口修復(fù)、炎癥活躍期免疫細(xì)胞供能和癌細(xì)胞的快速增殖供能等［1］。此外，長期慢性炎性疾病也可引起體內(nèi)氧利用不足而最終導(dǎo)致乳酸水平升高，包括慢性呼吸功能障礙、代謝性疾病和尿毒癥等［2］。近年來，研究者以乳酸為核心，在化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和運動醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開展了多項研究，形成了無氧閾和Warburg效應(yīng)等多種學(xué)說［3］。隨著能量代謝微環(huán)境和免疫調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入，乳酸在平衡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、調(diào)控肌肉再生、神經(jīng)發(fā)生和蛋白質(zhì)修飾等方面均有重要的作用［4-8］。乳酸研究由“代謝廢物”和“檢測指標(biāo)”進(jìn)入了“調(diào)節(jié)因子”的新范式。Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）是一類位于細(xì)胞表面高度保守的模式識別受體超家族，能夠識別多種病原體及炎性分子，參與炎癥反應(yīng)。研究［9］表明：巨噬細(xì)胞表面及內(nèi)部分布有多種TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10），且TLR4相關(guān)的信號傳導(dǎo)對巨噬細(xì)胞極化有關(guān)鍵的影響。接頭分子在TLRs信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)TLRs的接頭分子有5種，包括髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）、誘導(dǎo)β干擾素的Toll/白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白［Toll/IL-1receptor（TIR）domaincontainingadaptorproteininducinginterferon-β，TRIF］、類MyD88接頭分子（MyD88-adaptorlikeprotein，MAL）、TRIF相關(guān)接頭分子（TRIFrelatedadaptormolecule，TRAM）和包含TIR結(jié)構(gòu)域的分子等，不同TLRs家族成員可依賴一個或多個接頭分子傳導(dǎo)信號［10］。巨噬細(xì)胞廣泛存在于人體組織中，在免疫反應(yīng)中具有明顯的可塑性，即在不同的微環(huán)境或細(xì)胞外刺激物作用下巨噬細(xì)胞可發(fā)生M1極化或M2極化［11］。作為TLR4發(fā)揮生理功能的2個重要接頭分子，MyD88和TRIF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑分別為MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑，均參與了巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控［12］。研究［13-15］顯示：乳酸可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生M2極化，然而對于細(xì)胞內(nèi)部具體何種接頭分子參與乳酸引起M2極化的研究尚未見報道。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來快速發(fā)展的一項新技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于生命領(lǐng)域的研究［16］。本研究借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定向敲除接頭分子MyD88和TRIF，探討二者在促進(jìn)乳酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化中的作用，以期進(jìn)一步闡明相關(guān)機(jī)制，為乳酸的生物調(diào)控作用研究提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病Raw264.7細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞和大腸桿菌DH5-α（吉林醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥雙創(chuàng)轉(zhuǎn)化實訓(xùn)平臺實驗室保存）。pSPAX2、pMD2G、穿梭質(zhì)粒、pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen載體和LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑盒（上海漢恒生物科技有限公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（美國Axygen公司），RNA提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司），實時熒光定量PCR（real-timefluorescencequantitativePCR，RT-qPCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司），胎牛血清、1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶和Puromycin（美國Gibco公司），乳酸（美國Sigma公司），MyD88蛋白抗體、TRIF蛋白抗體、核因子κB抑制蛋白α（nuclearfactorκBinhibitorprotein-α，IκB-α）抗體和NF-κBp65蛋白（NF-κBp65protein，p65）抗體（美國CellSignalingTechnology公司），羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體（美國Proteintech公司），小鼠腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、γ干擾素（interferon-γ，INF-γ）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司），ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國GE公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），InfiniteF500多功能高端酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），高端凝膠成像系統(tǒng)（美國AlphaInnotech公司）。1.2引物序列設(shè)計本研究所采用的引物由吉林省庫美生物科技有限公司設(shè)計合成。見表1。表1PCR引物序列Tab.1PrimersequencesofPCR1.3慢病毒法制備Raw264.7-Cas9細(xì)胞將pSPAX2、pMD2G和攜帶Cas9穿梭質(zhì)粒擴(kuò)增，抽提后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72h后，收集上清，去除細(xì)胞碎片后，10000g離心2h，上清中獲取高滴度HBLV-Cas9-PURO慢病毒，稀釋計數(shù)法測定病毒滴度。Raw264.7細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度生長至約50%時，以病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）為20感染HBLV-Cas9-PURO。24h后更換含10g·L－1Puromycin新鮮完全培養(yǎng)液。收獲細(xì)胞以進(jìn)行基因敲除。提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、PCR和瓊脂糖電泳觀察Cas9基因表達(dá)情況，采用熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況。1.4MyD88和TRIF基因敲除細(xì)胞制備根據(jù)小鼠MyD88和TRIF在NCBI的基因序列，設(shè)計向?qū)NA（guideRNA，gRNA）序列，引物序列由吉林省庫美生物科技有限公司設(shè)計合成（表2）。序列合成后，退火為雙鏈Oligo序列，T4連接酶接入含ZsGreen熒光標(biāo)記的pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen線性化表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，Amp抗性平板37℃培養(yǎng)過夜，挑菌并擴(kuò)大培養(yǎng)。將測序驗證正確的DH5α陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、慢病毒包裝及滴度測定。表2gRNA寡核苷酸序列Tab.2SequencesofgRNAoligonucleotidesRaw264.7-Cas9細(xì)胞以5×105mL－1密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至約50%時，以MOI為30感染包裝的各組慢病毒，感染24h后更換含10mg·L－1Puromycin新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～3d，以獲得穩(wěn)定基因敲除細(xì)胞株。感染MyD88-gRNA慢病毒細(xì)胞為MyD88-KO細(xì)胞組，感染TRIF-gRNA慢病毒細(xì)胞為TRIF-KO細(xì)胞組，未感染Raw264.7細(xì)胞為對照組。1.5RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中MyD88和TRIFmRNA表達(dá)水平收集對照組、MyD88-KO組和TRIF-KO組細(xì)胞，采用RNA快提試劑盒提取總RNA，微量紫外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR?GreenPCRMasterMix于熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。采用2－ΔΔCt法計算各組細(xì)胞中MyD88和TRIFmRNA表達(dá)水平。1.6Westernblotting法檢測各組細(xì)胞中MyD88和TRIF蛋白表達(dá)水平采用RIPA裂解液裂解對照組、MyD88-KO組和TRIF-KO組細(xì)胞，并提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每樣本取等量（50μg）蛋白10%SDS-PAG凝膠電泳，將電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVGF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉后，將膜分別與MyD88抗體（1∶2000）、TRIF抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶6000）4℃條件下孵育過夜，二抗室溫孵育1h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像。采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。1.7乳酸誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞極化按照Reference［14］中的方法，采用15mmol·L－1乳酸進(jìn)行極化誘導(dǎo)實驗，實驗分為未處理Raw264.7細(xì)胞組、Raw264.7+乳酸組、MyD88-KO組、MyD88-KO+乳酸組、TRIF-KO組和TRIF-KO+乳酸組，各乳酸組細(xì)胞均采用15mmol·L－1乳酸作用24h，收集上清和細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。采用RNA快提試劑盒提取總RNA，微量紫外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中巨噬細(xì)胞甘露糖受體CD206和精氨酸酶1（arginase1，Arg1）mRNA表達(dá)水平。采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、INF-γ和IL-10水平。15mmol·L－1乳酸作用各組細(xì)胞24h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量后SDS電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉1h，β-actin、TLR4、IκB-α和p65一抗（1∶6000、1∶1000、1∶4000和1∶2000）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)成像，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。1.8分子對接檢測乳酸與接頭分子結(jié)合采用Autodock軟件進(jìn)行分子對接，乳酸分子（ZINC4658560）結(jié)構(gòu)由ZINC數(shù)據(jù)庫下載，TLR4（7mlm）、MyD88（4eo7）和TRIF（3rc4）蛋白結(jié)構(gòu)由PBD數(shù)據(jù)庫下載，導(dǎo)入Autodock對接，選擇第一對接結(jié)構(gòu)并采用PyMOL軟件分析圖像。1.9統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。基因敲除各組細(xì)胞中MyD88及TRIFmRNA和蛋白表達(dá)水平，乳酸誘導(dǎo)后各組細(xì)胞中CD206和Arg1mRNA表達(dá)水平，細(xì)胞上清中TNF-α、INF-γ和IL-10水平，各組細(xì)胞中TLR4、IκB-α和p65蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1HBLV-Cas9-PURO慢病毒轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞和Cas9表達(dá)情況HBLV-Cas9-PURO慢病毒轉(zhuǎn)染后Cas9在Raw264.7細(xì)胞中成功表達(dá)，細(xì)胞呈明顯綠色熒光，表明構(gòu)建的慢病毒將Cas9成功導(dǎo)入并表達(dá)。見圖1和2。圖1Cas9PCR電泳圖Fig.1ElectrophoregramofCas9PCR2.2MyD88和TRIF基因敲除后各組細(xì)胞中MyD88及TRIFmRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組比較，MyD88-KO組細(xì)胞中MyD88mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），TRIF-KO組細(xì)胞TRIFmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），表明通過慢病毒方式的CRISPER/Cas9基因編輯方法成功敲除MyD88和TRIF。見圖3和4。圖3MyD88和TRIF敲除后各組細(xì)胞中MyD88和TRIFmRNA表達(dá)水平Fig.3ExpressionlevelsofMyD88andTRIFmRNAincellsinvariousgroupsafterknockoutofMyD88andTRIF2.3乳酸處理后各組細(xì)胞中CD206和Arg1mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)及細(xì)胞因子水平RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：與未處理Raw264.7細(xì)胞組比較，Raw264.7+乳酸組細(xì)胞中CD206和Arg1mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。與MyD88-KO組比較，MyD88-KO+乳酸組細(xì)胞中CD206和Arg1mRNA表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細(xì)胞中CD206和Arg1mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖5。圖5RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中CD206（A）和Arg1（B）mRNA表達(dá)水平Fig.5ExpressionlevelsofCD206（A）andArg1(B)mRNAinvariousgroupsdetectedbyRT-qPCRmethod圖2熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況（×40）Fig.2Transfectionoflentivirusobservedbyfluorescencemicroscope(×40)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)：與未處理Raw264.7細(xì)胞組比較，Raw264.7+乳酸組細(xì)胞表現(xiàn)出較為典型的M2極化形態(tài)，即體積增大、出現(xiàn)明顯的突起偽足和偏錐形細(xì)胞比例增加；MyD88-KO組和MyD88-KO+乳酸組細(xì)胞同樣表現(xiàn)出M2極化的形態(tài)表現(xiàn)；而TRIF-KO組和TRIF-KO+乳酸組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。見圖6。圖6光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×20）Fig.6Morphologyofcellsinvariousgroupsobservedbyopticalmicroscope(×20)ELISA法檢測結(jié)果顯示：與未處理Raw264.7細(xì)胞組比較，Raw264.7+乳酸組細(xì)胞上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），INF-γ和IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與MyD88-KO組比較，MyD88-KO+乳酸組細(xì)胞上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），INF-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），IL-10水平明顯升高（P＜0.05）；與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細(xì)胞上清液中TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），INF-γ和IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。表3各組細(xì)胞上清液中TNF-α、INF-γ和IL-10水平Tab.3LevelsofTNF-α,INF-γandIL-10incellsupernatantinvariousgroups[n=3，x±s，ρB/（ng·L－1）］圖4MyD88和TRIF敲除后各組細(xì)胞中MyD88和TRIF蛋白表達(dá)電泳圖（A，B）和直條圖（C，D）Fig.4Electrophoregram(A,B)andhistogram(C,D)ofexpressionsofMyD88andTRIFproteinsincellsinvariousgroupsafterknockoutofMyD88andTRIF2.4各組細(xì)胞中TLR4和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與未處理Raw264.7細(xì)胞組比較，其余各組細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Raw264.7+乳酸組細(xì)胞中IκB-α和p65蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與MyD88-KO組比較，MyD88-KO+乳酸組細(xì)胞中IκB-α和p65蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與TRIF-KO組比較，TRIF-KO+乳酸組細(xì)胞中IκB-α和p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。圖7Westernblotting法檢測各組細(xì)胞中TLR4，IκB-α和p65蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig.7Electrophoregram(A)andhistogram(B-D)ofexpressionsofofTLR4，IκB-αandp65proteinsincellsinvariousgroupsdetectedbyWesternblottingmethod2.5乳酸與TLR4、MyD88和TRIF結(jié)合情況乳酸與TLR4、MyD88和TRIF分子對接模擬結(jié)果顯示：乳酸與TLR4蛋白形成2個氫鍵，分別為ARG55：HH12和LYS128：HZ1，結(jié)合能為－2.72；乳酸與MyD88蛋白形成4個氫鍵，分別為GLU159：HN、ARG160：HN、LYS190：HZ3和LYS190：HZ2，結(jié)合能為－3.24；乳酸與TRIF蛋白形成4個氫鍵，分別為ARG1161：HH12、GLY1162：HN、ARG1161：HN和ARG1161：HE，結(jié)合能為－3.66。提示乳酸與TRIF蛋白結(jié)合優(yōu)于其與MyD88蛋白結(jié)合，與細(xì)胞實驗結(jié)果一致。見圖8。圖8乳酸與TLR4、MyD88和TRIF對接位點圖Fig.8MoleculardockingviewsoflactatewithTLR4,MyD88,andTRIF3討論近期研究［17-18］表明：乳酸可作為重要的能量代謝底物和信號分子影響諸多生理進(jìn)程。傷口愈合組織、實質(zhì)性腫瘤組織和慢性炎性疾病病灶組織中均具有較高濃度乳酸，該現(xiàn)象與細(xì)胞快速增殖的供能所需密不可分。而巨噬細(xì)胞作為傷口、腫瘤和部分慢性炎性疾病微環(huán)境的重要成員，高濃度乳酸對巨噬細(xì)胞的影響也被不斷報道［19-20］。巨噬細(xì)胞具有典型的可塑化特性，根據(jù)其功能變化可分為促進(jìn)炎癥的M1極化和抑制炎癥的M2極化［21］。研究［9］表明：巨噬細(xì)胞極化過程中TLR4接頭分子發(fā)揮重要作用。然而乳酸作用后巨噬細(xì)胞極化的具體機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究探討TLR4接頭分子是否參與巨噬細(xì)胞極化過程。TLR4作為首個發(fā)現(xiàn)的TLRs，廣泛分布于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等各類免疫細(xì)胞表面，是免疫反應(yīng)的重要靶點［22］。TLR4被細(xì)胞外刺激物激活后，可在細(xì)胞內(nèi)招募接頭分子調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終引起免疫細(xì)胞對外部刺激的反應(yīng)。巨噬細(xì)胞M2極化主要表現(xiàn)為抗炎性細(xì)胞因子分泌［IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）和趨化因子CC配體18（C-Cmotifchemokineligand18，CCL18）］、釋放活化因子［巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophagecolong-stimulatingfactor，MCSF）、IL-4和IL-13］和標(biāo)志性膜蛋白（CD206、Arg1、CD163、CD86和Fizz1）表達(dá)等［23］。本研究結(jié)果顯示：在乳酸誘導(dǎo)的M2極化過程中TLR4受體無明顯變化，提示乳酸可能并未直接