熒光法測定核黃蛋白

熒光法測定核黃蛋白-核黃素的解離常數(shù)李俊;張冬梅;陶力【摘要】@@本文推薦一個用熒光法測定配合物解離常數(shù)的實驗，實驗原理簡單,知識內(nèi)容跨學(xué)科，兼有生物化學(xué)和化學(xué)知識，有利于生化專業(yè)和化學(xué)專業(yè)的學(xué)生知識面的拓寬.【期刊名稱】《大學(xué)化學(xué)》【年(卷)，期】2000(015)003【總頁數(shù)】3頁(P39-41)【作者】李俊漲冬梅;陶力【作者單位】南京大學(xué)生物化學(xué)系，江蘇,210093浦京大學(xué)生物化學(xué)系，江蘇,210093;南京大學(xué)生物化學(xué)系，江蘇,210093【正文語種】中文［中圖分類】O6本文推薦一個用熒光法測定配合物解離常數(shù)的實驗，實驗原理簡單，知識內(nèi)容跨學(xué)科，兼有生物化學(xué)和化學(xué)知識，有利于生化專業(yè)和化學(xué)專業(yè)的學(xué)生知識面的拓寬。1實驗?zāi)康恼莆沼脽晒夥y定配合物解離常數(shù)的原理和方法；熟悉熒光光度計的使用。2實驗原理核黃素(riboflavin,Rf)，又稱維生素B2，它是黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)這兩種輔酶的前體，廣泛參與體內(nèi)生物氧化還原反應(yīng)，能促進(jìn)糖、脂和蛋白質(zhì)的代謝。核黃素的水溶液具有熒光，在一定的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與核黃素含量成正比，可用于定量測定。在雞蛋清中存在一種蛋白質(zhì)核黃蛋白(riboflavin-bindingprotein,RfBP),分子量為36000[1]，它能與核黃素按1:1的比例結(jié)合：核黃蛋白與生成的配合物核黃蛋白-核黃素都不具有熒光。因此，當(dāng)用核黃蛋白去“滴定”核黃素時，核黃素的熒光強(qiáng)度就會減弱，這種現(xiàn)象叫做〃熒光猝滅”。以熒光強(qiáng)度對核黃蛋白加入量作圖，就可以得到核黃蛋白的“滴定”曲線(圖1),根據(jù)這個“滴定”曲線，可以計算出該配合物的解離常數(shù)Kd。通常是分別求出每個實驗點(diǎn)的Kd，然后求平均值[2]。這里，我們采用作圖法來求該配合物的解離常數(shù)，方法如下：將曲線的直線部分延長交橫軸于A點(diǎn)，此點(diǎn)表示RfBP與Rf恰好等摩爾反應(yīng)。但由于配合物的解離，使得此時的熒光強(qiáng)度不為零，而是在圖中B點(diǎn)處對應(yīng)的熒光強(qiáng)度巳熒光增加的程度取決于配合物的穩(wěn)定性。設(shè)配合物不解離時在A處的濃度為c，配合物的解離度為a,則a=F7F,平衡時[RfBP?Rf]=(1-a)c[RfBP]=ac[Rf]=ac則配合物的解離常數(shù)Kd=[RfBP][Rf]/[RfBP?Rf]=a2c/(1-a)=(F7F)2?c/(1-F'/F)式中c為核黃素的濃度(nmol/L);F為加入核黃蛋白前溶液的熒光強(qiáng)度(即總的游離核黃素的熒光吸收)；『為曲線上讀出的熒光強(qiáng)度(即溶液中游離的核黃素的熒光吸收)。3材料和儀器實驗中使用的材料為雞蛋和透析袋(分子量不超過20000)；儀器為磁力攪拌器、低速離心機(jī)(5000r/min)和930型熒光光度計。4試劑6mmol/LHCl。0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5):6.07gTris用少量蒸餾水溶解，加入40mL1mol/LHCl,再用蒸餾水稀釋至1000mL。⑶核黃素貯備液：準(zhǔn)確稱取核黃素18.0mg,用少量蒸餾水溶解，加入1mL濃鹽酸并用蒸餾水稀釋至500mL。放置于冰箱中避光保存，兩個月內(nèi)有效。⑷核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(180pg/L):將核黃素貯備液用蒸餾水稀釋200倍。5實驗內(nèi)容5.1核黃蛋白的制備［2］將雞蛋殼敲破，小心倒出蛋清。加入等體積的蒸餾水(約25mL),磁攪拌10min后再離心10min(4000r/min)。上清液用20倍體積的6mmol/LHCl透析24h。再于20倍體積的0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)中透析24h［注］在雞蛋清中，核黃蛋白通常是以與核黃素結(jié)合成配合物的形式存在，在低pH下(小于4.0),核黃蛋白與核黃素分離，在高pH下(大于4.5)，核黃蛋白又能與核黃素結(jié)合，而蛋清中的其他蛋白質(zhì)均無此活性［3］。因此，在本實驗中，利用6mmol/LHCl將溶液的pH降至4.0以下，核黃蛋白與核黃素發(fā)生分離，通過透析將游離的核黃素和其他小分子除去而核黃蛋白留在透析袋中。核黃素在雞蛋清中的含量很少，而在蛋黃中含量較多，其主要存在形式也是蛋白質(zhì)結(jié)合物。通常情況下，核黃蛋白能將雞蛋中沉積的核黃素以配合物的形式儲存，在需要時(如雞蛋孵化過程中)再通過一定的生物代謝過程將核黃素釋放出來。，兩次透析均在4°C下進(jìn)行(4°C的冷藏柜)。在透析過程中，有部分的變性雜蛋白沉淀下來，透析完后將袋內(nèi)的溶液離心10min(4000r/min),棄去沉淀，取上清液即得核黃蛋白溶液，將此溶液用蒸餾水稀釋2倍后于4C保存?zhèn)溆谩?.2核黃素-核黃蛋白配合物的解離常數(shù)的測定取11支試管，按表1進(jìn)行操作。核黃素見光會分解，因此實驗過程中應(yīng)注意避免核黃素受陽光直接照射。加入核黃蛋白溶液，混勻后立即進(jìn)行熒光測定。核黃素的激發(fā)波長為460nm,發(fā)射波長為520nm。因此可選用帶通型400nm(藍(lán)色)濾色片為激發(fā)光濾色片，選用截止型510nm(紅色)濾色片為發(fā)射光濾色片。按照熒光光度計的使用說明調(diào)節(jié)儀器，以第一支試管作為參比溶液，調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度讀數(shù)至滿刻度(100%)，然后依次測定各管的相對熒光強(qiáng)度Fi，并將測定結(jié)果填入表1。以相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，加入的RfBP的體積(mL)為橫坐標(biāo)，繪制〃滴定”曲線(圖2)。將水平漸近線反向延長交縱軸于C點(diǎn)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為F0，則解離度可用下式計算：a=(F'-F0)/(F-F0)由此求出配合物的解離常數(shù)Kd。表1核黃素-核黃蛋白配合物的解離常數(shù)的測定試管號V(核黃素標(biāo)準(zhǔn)液)/mLV(Tris-HCl緩沖液)/mLV(RfBP)/mLFi0123456789103.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.02.952.902.852.802.752.702.652.602.552.500.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50圖1核黃蛋白的理論“滴定”曲線圖2核黃蛋白的實際“滴定”曲線6結(jié)果與討論實際的測量過程中，當(dāng)核黃蛋白過量時，熒光強(qiáng)度并非趨近于零，而是趨近于一條平行于橫軸的直線（圖2）,與理論曲線有一定的差別。這可能是由以下兩個原因造成的:①核黃蛋白與核黃素結(jié)合后，熒光并未被完全猝滅；②當(dāng)核黃蛋白過量時，由于過量的核黃蛋白而產(chǎn)生一定的散射效應(yīng)，這使得熒光發(fā)射大于零，即有一定的熒光背景，因此需要扣除由此產(chǎn)生的相對熒光強(qiáng)度。實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核黃蛋白過量至一定程度時（加入0.8mL），熒光發(fā)射有增大的趨勢，這證實了上面的推測。實際測得配合物的解離度a為0.049,Kd值為1.20x10-9mol/L,與文獻(xiàn)值［4］的1.30x10-9mol/L非常接近。參考文獻(xiàn)RhodesMB,BennettN,FeeneyRE.JBiolChem,1959,234:2054HuJY,S