細(xì)胞工程筆記

1/1細(xì)胞工程筆記第一章緒論一、細(xì)胞工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位

生物技術(shù)的概念：“New”Biotechnology—theuseofcellularandbiomolecularprocessestosolveproblemsormakeusefulproducts.(CB.Feldbaum,2004)現(xiàn)代生物技術(shù)的的主要領(lǐng)域發(fā)酵工程：利用微生物的特定性狀，通過現(xiàn)代工程技術(shù)，在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的術(shù)。如：當(dāng)前的食品、醫(yī)用和農(nóng)用抗生素絕大部分是發(fā)酵產(chǎn)品，此外還包括氨基酸、工業(yè)用酶，日常生活中的味精、維生素B2等。酶工程：利用酶的催化作用，采用適當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)器工業(yè)化的生產(chǎn)人類所需的產(chǎn)品或是達(dá)到某一特殊目的的一門生物工程技術(shù)。如：α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶三酶連續(xù)作用于淀粉，就可以代替蔗糖生產(chǎn)出高果糖漿；蛋白酶用于皮革脫毛、脫膠和洗滌劑工業(yè)等；日常生活中的加酶洗衣粉，嫩肉粉等?；蚬こ蹋焊鶕?jù)人們的意愿對(duì)不同生物的遺傳基因進(jìn)行切割、拼接或重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新遺傳性狀的生物類型的一門技術(shù)，又稱重組DNA技術(shù)。如：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、干擾素、生長因子等藥物。蛋白質(zhì)工程：利用生物技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進(jìn)行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的技術(shù)。又稱“第二代基因工程”。如：提高葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性、速效胰島素、嵌合抗體、治癌酶的改造等。生物化學(xué)工程：應(yīng)用化學(xué)工程的原理和方法，研究解決生物反應(yīng)過程中的基礎(chǔ)理論及工程技術(shù)問題。如：新型生物反應(yīng)器系統(tǒng)及相關(guān)培養(yǎng)和放大技術(shù)、工藝的研究與開發(fā)，新型分離方法和設(shè)備的研究開發(fā)，描述生物反應(yīng)過程的數(shù)學(xué)模型的建立，生產(chǎn)過程在線檢測和控制手段的完善等。細(xì)胞工程地位：細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的橋梁和紐帶二、細(xì)胞工程學(xué)的概念及研究范疇

1、概念和分類概念：以生物細(xì)胞、組織或器官為研究對(duì)象，運(yùn)用生命科學(xué)理論，以及工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的的利用和改造生物遺傳特性或生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。根據(jù)研究對(duì)象不同，可分為植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程2、細(xì)胞工程學(xué)的研究領(lǐng)域原生質(zhì)體培養(yǎng)（protoplastculture）組織、器官或細(xì)胞培養(yǎng)（tissue,organorcellculture）植物胚胎培養(yǎng)(embryoculture)染色體工程（chromosomeengineering）轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物（transgeneticanimalandplant）動(dòng)物胚胎移植、胚胎培養(yǎng)和試管動(dòng)物（embryotransfer,embryoculture,tubeanimal）克隆動(dòng)物（clonedanimal）3、細(xì)胞工程學(xué)的研究任務(wù)細(xì)胞、組織或器官的形態(tài)發(fā)生規(guī)律；研究離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞、組織或器官所需營養(yǎng)條件和環(huán)境條件；細(xì)胞融合方法和機(jī)理；植物材料的快速大量繁殖方法；種質(zhì)資源的離體保存機(jī)理和方法；動(dòng)物胚胎移植、胚胎體外生產(chǎn)及動(dòng)物克隆技術(shù)等；再生個(gè)體的遺傳和變異；改良生物品種，創(chuàng)造新的生物種類，為人類造福。三、細(xì)胞工程學(xué)發(fā)展歷史

一）植物細(xì)胞工程發(fā)展史19世紀(jì)末和20世紀(jì)初探索期（1859-1929）、成熟期（1930-1959）和迅速發(fā)展期（1960年至今）理論基礎(chǔ)：生物細(xì)胞的全能型(totipotency）：個(gè)體或組織、器官已經(jīng)分化的細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下具有再生成完整個(gè)體的遺傳潛能。1、探索期1902年GottlichHaberlandt（德.哈泊蘭德）根據(jù)細(xì)胞理論提出植物可以不斷分割至單個(gè)細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下單細(xì)胞具有發(fā)育成完整植株的能力。celltheoryAlllifeformsaremadefromoneormorecells.Thecellisthesmallestformoflife.Cellsonlyarisefrompre-existingcells.“如果具有與有機(jī)體內(nèi)一樣的條件時(shí)，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)該可以獨(dú)立生活和發(fā)展”(《細(xì)胞學(xué)》Schwann,1839)——這一論點(diǎn)成為組織培養(yǎng)研究的思想基礎(chǔ)。隨后，許多科學(xué)家從事組織培養(yǎng)研究。1904年，德國植物胚胎學(xué)家Hanning（漢寧）用蘿卜和辣根的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，提早長成了小植株。常規(guī)：幼胚→（成熟）種子→（發(fā)芽）植株組織培養(yǎng)：幼胚→（培養(yǎng)）植株首次獲得植物器官（胚）離體培養(yǎng)成功。1922年，Kotte（德，科特）和Robbins（美，羅賓斯）對(duì)豌豆、玉米、棉花等的莖尖、根尖進(jìn)行了離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了培養(yǎng)的分生組織能進(jìn)行有限的生長。首次植物組織培養(yǎng)。1925年，Laibach（德，萊巴赫）進(jìn)行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功得到了雜種植物。證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交中利用的可能性。2..成熟期White、Gautheret、Nobecourt等科學(xué)家被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。40年代末開始，從脫分化細(xì)胞組織培養(yǎng)進(jìn)入探討器官再分化的研究。細(xì)胞（組織、器官）→【脫分化】愈傷組織（分生細(xì)胞）→【再分化】不定芽、根（雙極性胚狀體）→植株1957年Skoog（美，史庫克）和Miller（米勒）提出了植物激素控制器官形成的概念，首次證實(shí)IAA/BA的比例是組織培養(yǎng)中控制根和芽形成的重要條件。1958年Steward（英，斯圖爾德）和Reinert（德，雷那特）從胡蘿卜根的懸浮細(xì)胞中成功從單個(gè)細(xì)胞誘導(dǎo)出成熟的體細(xì)胞胚，首次證實(shí)了細(xì)胞全能性學(xué)說。3、迅速發(fā)展期1）原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合1971年，Takebe（日，塔克伯）等從煙草原生質(zhì)體得到再生植株，首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。1972年，Carlson（美，卡爾森）等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株。1978年，Melchers（梅爾徹斯）進(jìn)行了馬鈴薯和番茄的融合實(shí)驗(yàn)，獲得了第一個(gè)屬間雜種植株。2）微繁技術(shù)1960年，Morel（法，莫里爾）提出了利用莖尖離體快速無性繁殖蘭花的方法，在此基礎(chǔ)上，國際上建立了蘭花工業(yè)，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。3）花藥培養(yǎng)技術(shù)1973年，Nitch采用花藥預(yù)培養(yǎng)的方法，首次獲得了煙草花粉植株。4）次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)1959年，Tulecke和Nickell首先進(jìn)行了較大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，在一個(gè)20L的植物細(xì)胞封閉式懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，成功培養(yǎng)了銀杏、冬青等細(xì)胞。20世紀(jì)80年代植物細(xì)胞工程技術(shù)開始大規(guī)模應(yīng)用于植物遺傳改良和快速繁殖，在人工種子、種質(zhì)資源的保存和細(xì)胞培養(yǎng)次生代謝物質(zhì)也進(jìn)行了研究和開發(fā)。1985年首批轉(zhuǎn)基因植物（抗蟲/抗病毒）開始進(jìn)行田間試驗(yàn)，1986年美國EPA批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因煙草的釋放。1994年美國FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因食品FlavrSavrTM西紅柿。二）動(dòng)物細(xì)胞工程發(fā)展史1、培養(yǎng)技術(shù)1907年，Harrison首先培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)管細(xì)胞，并觀察到有新的神經(jīng)細(xì)胞生成。這標(biāo)志著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的開始。1911年，Carrel發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的生長促進(jìn)作用，并首次把無菌技術(shù)引入組織培養(yǎng)技術(shù)中。1914年，Thomson建立了器官培養(yǎng)技術(shù)。1940年，1951年，Earle和Gey分別建立了C3H小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系的L系和人體細(xì)胞系—人體宮頸癌Hela細(xì)胞系。2、細(xì)胞融合技術(shù)1958年，Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活仙臺(tái)病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。1965年，Harris誘導(dǎo)不同動(dòng)物體細(xì)胞融合獲得成功并培養(yǎng)存活。1964年，Lifflefield根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用HAT選擇性培養(yǎng)基使親本細(xì)胞死亡而只留下異型融合細(xì)胞，并能不斷增殖，從此形成了細(xì)胞融合到雜種細(xì)胞選擇、培養(yǎng)的一整套技術(shù)。1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。3、多倍體誘導(dǎo)技術(shù)1959年，Swarup用低溫處理三棘刺魚獲得了三倍體，并飼養(yǎng)至性成熟。現(xiàn)在人工誘導(dǎo)多倍體已成為經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物育種的主要技術(shù)。4、克隆技術(shù)首例克隆動(dòng)物成功的報(bào)道是在1962年，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾受精卵（經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核）中，約有1%的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。1997年2月，Wilmut（英）在《Nature》報(bào)道了世界第一只克隆羊的誕生。第二章細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)2.2細(xì)胞增殖、生長與衰亡細(xì)胞增殖(cellproliferation)：單細(xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個(gè)體數(shù)量的增加。多細(xì)胞生物由一個(gè)單細(xì)胞即受精卵分裂發(fā)育而來，細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物繁殖基礎(chǔ)。成體生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個(gè)體細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)平衡和機(jī)體的正常功能。機(jī)體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴細(xì)胞增殖。2.2.1細(xì)胞周期（cellcycle）細(xì)胞周期（cellcycle）：連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始，到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。DNA合成前期（pre-DNAsynthesis,G1期）DNA合成期（phaseofDNAsynthesis,S期）DNA合成后期（post-DNAsynthesis,G2期）細(xì)胞分裂期（phaseofcelldivision,M期）有絲分裂（mitosis）減數(shù)分裂（meiosis）無絲分裂（amitosis）2.2.2細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂（celldivision）：是細(xì)胞一分為二的增殖過程，從而產(chǎn)生新細(xì)胞。無絲分裂特征：分裂速度快，不出現(xiàn)染色體和紡錘體等結(jié)構(gòu)，核膜核仁也不消失。有絲分裂：即體細(xì)胞分裂，通過分裂產(chǎn)生同樣染色體數(shù)目的子細(xì)胞,包括核分裂和胞質(zhì)分裂兩個(gè)過程。前期(prophase)中期(metaphase)后期(anaphase)末期(telophase)胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細(xì)胞分裂后期，在赤道板周圍細(xì)胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體和鈣離子濃度的變化有關(guān)。胞質(zhì)分裂開始時(shí)，大量肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白在中體處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細(xì)胞，稱為收縮環(huán)（contractilering)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán)處細(xì)胞膜融合并形成兩個(gè)子細(xì)胞。植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂：與動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)分裂不同的是，植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂是因?yàn)樵诩?xì)胞內(nèi)形成新的細(xì)胞膜和胞壁而將細(xì)胞分開植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂有絲分裂的意義有絲分裂的過程是親代細(xì)胞的染色體復(fù)制，再平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，從而保證了親、子代兩代細(xì)胞中含有相同數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體，在親子代之間保持遺傳性狀的穩(wěn)定性和遺傳性。減數(shù)分裂（MEIOSIS）：是細(xì)胞僅進(jìn)行一次DNA復(fù)制，隨后進(jìn)行兩次分裂，染色體數(shù)目減半的一種特殊的有絲分裂，僅出現(xiàn)在生殖細(xì)胞成熟過程中。減數(shù)分裂的意義:1、遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，導(dǎo)致染色體數(shù)目減半；2、S期持續(xù)時(shí)間較長；

3、同源染色體在減數(shù)分裂期I(MeiosisI)配對(duì)聯(lián)會(huì)、基因重組；

4、減數(shù)分裂同源染色體配對(duì)排列在中期板上，第一次分裂時(shí)，同源染色體分開。減數(shù)分裂的特點(diǎn)：1、遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，導(dǎo)致染色體數(shù)目減半；2、S期持續(xù)時(shí)間較長；3、同源染色體在減數(shù)分裂期I(MeiosisI)配對(duì)聯(lián)會(huì)、基因重組；4、減數(shù)分裂同源染色體配對(duì)排列在中期板上，第一次分裂時(shí)，同源染色體分開。2.2.3細(xì)胞衰老衰老（senescing,aging）是機(jī)體在退化時(shí)期生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)，是不可逆的生命過程。單細(xì)胞生物：細(xì)胞衰老或死亡就是個(gè)體衰老或死亡多細(xì)胞生物：細(xì)胞衰老不等同于個(gè)體衰老細(xì)胞衰老機(jī)制差錯(cuò)學(xué)派代謝廢物積累自由基學(xué)說線粒體損傷假說體細(xì)胞突變與DNA修復(fù)遺傳學(xué)派基因程序理論復(fù)制性衰老（端粒假說）長壽基因端粒由端粒DNA和與端粒DNA特異結(jié)合的端粒結(jié)合蛋白組成的核糖核酸的蛋白質(zhì)復(fù)合物。端粒DNA由非編碼的重復(fù)序列組成，不同物種的DNA重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)不同。不同的真核細(xì)胞端粒存在類似的DNA序列與結(jié)構(gòu)，且高度保守。其共同的特征是富含G，而且富含G的鏈(5′→3′)比富含C的鏈(3′→5′)突出12~16個(gè)核苷酸。端粒結(jié)合蛋白TBPs：雙鏈TBPs和單鏈TBPs。端粒酶的實(shí)質(zhì)是一種自身攜帶模板的反轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)亞基組成，能維持端粒的長度人端粒酶RNA模板區(qū)與端粒的3’末端結(jié)合后,利用其本身的片段合成端粒DNA，到達(dá)模板的5’端后，通過移位，又與新合成的端粒DNA結(jié)合，合成新的端粒片段。(引自GriederC,BlackburnE.In:Nature1990:345:458-460.)細(xì)胞壞死（necrosis）：指細(xì)胞遭受到強(qiáng)烈有害損傷條件（物理、化學(xué)、生理）刺激時(shí)，出現(xiàn)的一種被動(dòng)的、突發(fā)性的、非生理性死亡。表現(xiàn)：膜通透性增加，細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核染色質(zhì)不規(guī)則的位移，線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢等，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡Apoptosis，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，指特定的內(nèi)部或外部因素誘導(dǎo)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)有基因編碼的“死亡程序”，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。這是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過程?！馎poptosis的概念源自于希臘語，原意是指樹葉或花的自然凋落；●細(xì)胞發(fā)生程序性死亡時(shí)，就像樹葉或花的自然凋落一樣，凋亡的細(xì)胞散在于正常組織細(xì)胞中，無炎癥反應(yīng)，不遺留疤痕?！袼劳龅募?xì)胞碎片很快被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除，不影響其他細(xì)胞的正常功能。細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。細(xì)胞質(zhì)向外出芽，形成膜包圍的凋亡小體凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化典型的apoptosis癥狀：圓形細(xì)胞沒有微絨毛，互相分離，染色質(zhì)凝縮成新月狀，與核膜相連。線粒體結(jié)構(gòu)保存完整多核糖體仍然可見，有自動(dòng)吞噬泡細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡2.3配子發(fā)生與胚胎發(fā)育生物生殖方式：無性生殖（asexualreproduction）有性生殖（sexualreproduction）無融合生殖（apomixis）有性生殖：通過性細(xì)胞的產(chǎn)生、融合并進(jìn)一步發(fā)育成新個(gè)體的生殖方式。2.3.2受精受精（fertilization）：指雌配子（femalegamete）和雄配子（malegamete）融合為合子（zygote）或受精卵（oosperm）。2.3.3胚胎發(fā)育受精卵通過細(xì)胞生長、分裂和分化形成各種形態(tài)和功能不同的細(xì)胞，發(fā)育成動(dòng)植物有機(jī)體的過程。胚盤上、下方出現(xiàn)腔：羊膜腔amnioticcavity:上胚層靠滋養(yǎng)層側(cè)。卵黃囊yolksac:下胚層靠胚泡腔側(cè)。原腸作用形成三胚層：外胚層、中胚層、內(nèi)胚層2.4細(xì)胞分化和細(xì)胞決定2.4.1細(xì)胞分化細(xì)胞分化：在個(gè)體發(fā)育中，細(xì)胞的后代在化學(xué)組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上產(chǎn)生差異的過程稱為細(xì)胞分化(differentiation)。其本質(zhì)是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，即基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果。細(xì)胞分化的基本特征:細(xì)胞形態(tài)和功能間出現(xiàn)穩(wěn)定差異細(xì)胞生理狀態(tài)發(fā)生改變細(xì)胞分化潛能逐漸變窄細(xì)胞核分化潛能保持完整單細(xì)胞有機(jī)體的細(xì)胞分化與多細(xì)胞有機(jī)體的細(xì)胞分化不同之處：前者多為適應(yīng)不同的生活環(huán)境，而后者則通過細(xì)胞分化構(gòu)建執(zhí)行不同功能的組織與器官。多細(xì)胞有機(jī)體在其分化程序與調(diào)節(jié)機(jī)制方面顯得更為復(fù)雜。分化細(xì)胞的基本特征:個(gè)體中所有不同種類的細(xì)胞的遺傳背景完全一樣。分化細(xì)胞彼此之間在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能方面的不同是由于其擁有不同的蛋白質(zhì)所致。細(xì)胞分化中最顯著的特點(diǎn)是分化狀態(tài)的穩(wěn)定性。雖然細(xì)胞分化是一種相對(duì)穩(wěn)定和持久的過程,但是在一定的條件下,細(xì)胞分化又是可逆的。根據(jù)細(xì)胞的特化程度和分裂能力不同分類分化程度進(jìn)行有絲分裂能力舉例無能表皮基細(xì)胞，精原細(xì)胞、植物生長點(diǎn)細(xì)胞有一定程度能花粉母細(xì)胞和花粉之間的一系列細(xì)胞、動(dòng)物精原細(xì)胞和精子之間的一系列細(xì)胞等。高度分化無（動(dòng)物分可逆、不可逆細(xì)胞）根、莖、葉等組織或器官中的細(xì)胞，骨骼纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞各種高度分化的細(xì)胞和組織都具有細(xì)胞全能性。細(xì)胞核全能性：動(dòng)物細(xì)胞隨分化程度的提高分化潛能逐漸變窄，但對(duì)于細(xì)胞核而言，高度分化的細(xì)胞保留著物種的全套基因，仍具有發(fā)育全能性。干細(xì)胞：具有無限的或可被延長的自我更新和分化成不同組織細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞。按來源分：胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞）按功能分：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞造血干細(xì)胞多能定向干細(xì)胞單能定向干細(xì)胞成熟子代細(xì)胞髓系干細(xì)胞紅系干細(xì)胞

粒、單核系干細(xì)胞

巨核干細(xì)胞紅細(xì)胞

粒細(xì)胞/單核細(xì)胞

血小板淋巴系干細(xì)胞前驅(qū)B細(xì)胞

前驅(qū)T細(xì)胞B細(xì)胞

T細(xì)胞干細(xì)胞具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；②干細(xì)胞能無限的分裂；③干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能在兩種途徑中選擇其一：或保持親代特征，仍作為干細(xì)胞；或不可逆地向終末分化。2.4.2細(xì)胞決定（celldetermination）概念：細(xì)胞在發(fā)生可識(shí)別的形態(tài)和功能變化之前，就已受到約束而向著特定方向分化，這種細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)被穩(wěn)定地確定的過程稱為細(xì)胞決定。胚胎細(xì)胞分化的潛能與決定的關(guān)系：細(xì)胞決定可看作發(fā)育潛能逐漸限制的過程,決定先于分化。植物細(xì)胞：第一次細(xì)胞分裂（極性）哺乳類動(dòng)物胚胎細(xì)胞：16細(xì)胞期兩棲類胚胎細(xì)胞：三胚層形成（細(xì)胞空間關(guān)系的改變和微環(huán)境的差異）卵細(xì)胞質(zhì)在早期胚胎細(xì)胞決定中的作用：從受精卵第一次卵裂開始,細(xì)胞核就受到內(nèi)環(huán)境(即不同的卵細(xì)胞質(zhì))的影響。細(xì)胞質(zhì)中決定細(xì)胞命運(yùn)的特殊信號(hào)物質(zhì)稱為細(xì)胞質(zhì)決定子(cytoplasmicdeterminants)。決定子支配著細(xì)胞分化的途徑。受精卵在數(shù)次卵裂中,決定子一次次地被重新改組、分配。卵裂后,決定子的位置固定下來,并分配到不同的細(xì)胞中,子細(xì)胞便產(chǎn)生差別。卵細(xì)胞質(zhì)的母體效應(yīng)(maternal-effect)：卵母細(xì)胞中貯存的mRNA和蛋白質(zhì)的分布是不均勻的，各種mRNA在細(xì)胞中都有定位分布，并隨卵裂進(jìn)入不同的子細(xì)胞中。細(xì)胞決定的穩(wěn)定性和遺傳性:細(xì)胞決定一旦發(fā)生，就沿著決定方向分化成特定細(xì)胞類型，這種分化具有穩(wěn)定性和遺傳性。2.4.3細(xì)胞分化中的核質(zhì)關(guān)系細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞核的作用：影響細(xì)胞核基因的表達(dá)。當(dāng)雞的紅細(xì)胞與培養(yǎng)的人Hela細(xì)胞(去分化的癌細(xì)胞)融合后，核的體積增大20倍，染色質(zhì)松散，出現(xiàn)RNA和DNA合成，雞紅細(xì)胞核的重新激活是由于Hela細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)的結(jié)果；將培養(yǎng)的爪蟾腎細(xì)胞核注入蠑螈的卵母細(xì)胞內(nèi)，分析蛋白質(zhì)合成情況發(fā)現(xiàn)，原來在腎細(xì)胞中表達(dá)的基因，這時(shí)不表達(dá)，而原來不表達(dá)的基因，這時(shí)卻被激活。細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞質(zhì)的作用:個(gè)體的發(fā)育受細(xì)胞核的控制。部分基因被激活，導(dǎo)致特異蛋白的合成，執(zhí)行不同功能，引起細(xì)胞分化。生物基因組中基因分類：1.持家基因：維持細(xì)胞生存所必須的基因。2.組織專一性基因（奢侈基因）：在各種組織細(xì)胞中專一性選擇表達(dá)的基因。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核在細(xì)胞分化過程中具有非常密切的協(xié)調(diào)關(guān)系，未分化或已分化的核與細(xì)胞質(zhì)協(xié)調(diào)而發(fā)生正常的分化，發(fā)育成正常的胚。第三章細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及基本操作外植體：離體條件下生物有機(jī)體的各部分組織、器官或細(xì)胞，統(tǒng)稱為外植體。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室：洗滌、培養(yǎng)基的配置和消毒無菌操作室：超凈工作臺(tái)和附屬設(shè)備培養(yǎng)室：光源、培養(yǎng)架、溫度和濕度等控制設(shè)備鑒定實(shí)驗(yàn)室：顯微鏡、離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度計(jì)等細(xì)胞學(xué)和生理生化設(shè)備移栽馴化基地：溫室、移栽基質(zhì)、環(huán)境控制設(shè)備等準(zhǔn)備室（洗滌區(qū)、滅菌區(qū)、儲(chǔ)藏區(qū)、配置區(qū)）——明亮、通風(fēng)無菌操作室（緩沖準(zhǔn)備區(qū)、接種區(qū)）——封閉性好，干燥清潔，保持無菌培養(yǎng)室——控制光照和溫度，保持干燥和清潔鑒定實(shí)驗(yàn)室——清潔、明亮、干燥二、儀器設(shè)備基本設(shè)備滅菌設(shè)備無菌操作設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備觀察分析儀器設(shè)備三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具玻璃器皿新型材料器皿金屬材質(zhì)用具第二節(jié)基本操作清洗消毒滅菌無菌操作接種技術(shù)一洗滌玻璃器皿新器皿上附有游離的堿性物質(zhì)。洗滌劑→清水→1%的HCl溶液→清水→蒸餾水→干燥除去殘?jiān)礈靹逅麴s水→干燥洗凈的玻璃器皿不應(yīng)在器壁上帶有水珠，否則沖洗，如果仍掛有水珠，則需要洗滌液浸泡數(shù)小時(shí)（或用去污粉擦洗），重新清洗。塑料器皿質(zhì)地軟，附著力強(qiáng)。購買無毒并已經(jīng)消毒滅菌密封包裝的一次性商品，直接使用。用后立即浸入水中→2%NaOH→清水→5%鹽酸→清水→蒸餾水→干燥金屬器械不宜用各種洗滌液，一般用酒精擦洗，并保持干燥。不銹鋼制品也可用洗滌劑洗刷，用清水沖洗干凈，蒸餾水沖洗1~2次，晾干（或烘干）。其他用途的玻璃制品吸管、滴管等內(nèi)徑狹小的玻璃制品：需先放入鉻酸洗滌液中浸泡兩小時(shí)以上，取出后經(jīng)流水沖洗半小時(shí)左右，再用蒸餾水沖洗1～2次，然后烘干或晾干。載玻片和蓋玻片：洗滌時(shí)不宜用力擦洗，其洗滌方法是先用清水沖洗，然后放入鉻酸洗滌液中浸泡幾小時(shí)或用稀鉻酸洗滌液煮沸半小時(shí)，取出后用清水沖洗干凈，將其儲(chǔ)藏在95%的酒精中。二、消毒滅菌消毒：指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法。滅菌：指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。分類：物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理；物理除菌過濾、離心沉淀等化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌1、干熱滅菌a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死?！具m用范圍】接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌，此法徹底可靠，滅菌迅速，【缺點(diǎn)】易焚毀物品，所以使用范圍有限。b.干熱空氣滅菌法：利用烘箱進(jìn)行烘烤滅菌的方法?！疽蟆考窗汛郎缇奈锲肪鶆虻胤湃牒嫦渲?，150℃/40min或120℃/2h，有的（芽胞桿菌）甚至160【適用范圍】玻璃皿、金屬用具等的滅菌。2、濕熱滅菌a.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62℃，30b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細(xì)菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石碳酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100℃，15-30分鐘，殺死其中的營養(yǎng)體。然后冷卻，放入37℃恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2d.加壓蒸汽滅菌法：加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行的，以大量蒸汽使其中壓力升高,由于蒸汽壓的上升，水的沸點(diǎn)也隨之提高。在蒸汽壓達(dá)到兩個(gè)大氣壓時(shí)，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達(dá)到121℃。微生物（包括芽孢）在15-20高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種方法。【適用范圍】布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿及某些培養(yǎng)用液等耐高溫材料?！疽蟆砍２捎?千克/厘米2(15磅/英寸2)的蒸汽壓，121℃溫度下15-30分鐘

3、紫外線消毒紫外線作用于細(xì)胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。另外，空氣在紫外線照射下可以產(chǎn)生臭氧，臭氧也有一定的殺菌作用?！具m用范圍】紫外線透過物質(zhì)的能力很差，適用于空氣及物體表面的滅菌?！疽蟆浚?）照射時(shí)間以視紫外線燈管的功率大小、被照空間及面積大小，根據(jù)滅菌效果測定結(jié)果而定；（2）各種細(xì)菌照射時(shí)間和劑量也不同?！救秉c(diǎn)】（1）產(chǎn)生臭氧，污染空氣，對(duì)身體有害；（2）射線照射不到的部位起不到消毒作用，故消毒時(shí)，物品不宜相互遮擋。【注意】

不要在紫外線燈照射下進(jìn)行4、濾過消毒一些化學(xué)成分在高溫高壓下會(huì)發(fā)生降解而失去或降低效能。當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器或離心等方法?！具m用范圍】大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)液、血清、酶溶液、DNA溶液等【常用濾器】Zeiss濾器、微孔濾膜濾器及各種不同規(guī)格的一次性濾器。常用孔徑0.22~0.45um濾膜過濾一般用液即可?！咀⒁狻繛V器和濾膜事先經(jīng)高壓蒸汽滅菌。三、無菌操作培養(yǎng)材料的滅菌處理器具的滅菌處理超凈超作臺(tái)的滅菌處理無菌操作接種技術(shù)3、器具的滅菌干熱滅菌：160~170℃/1~2h;濕熱滅菌：118kPa/20~30min;酒精滅菌：70％~75％;燒灼滅菌：4、超凈操作臺(tái)的消毒滅菌開關(guān)控制裝置通風(fēng)過濾裝置照明裝置紫外滅菌裝置其他裝置無菌操作室的滅菌：紫外燈20~30min，70％~75％酒精噴霧；超凈操作臺(tái)的消毒：紫外燈20~30min，70％~75％的酒精擦拭臺(tái)面和器具，正常通風(fēng)10min以上第三節(jié)培養(yǎng)基的配置1愈傷組織缺無機(jī)營養(yǎng)表現(xiàn)癥狀：N——某些組織（如五葉地錦）表現(xiàn)花色素苷顏色；不能形成導(dǎo)管N、P和K——細(xì)胞過度生長，形成層組織減退S——愈傷組織非常明顯褪綠Fe——細(xì)胞分裂停止B——細(xì)胞分裂停滯，細(xì)胞伸長Mg和Mn——影響細(xì)胞伸長2營養(yǎng)物質(zhì)有機(jī)化合物氨基酸類：為組織培養(yǎng)提供有機(jī)氮源和一些活性成分。如：甘氨酸、水解酪蛋白、水解乳蛋白。維生素：與植物體內(nèi)的各種酶的作用有關(guān)，在植物組織培養(yǎng)中常用B族維生素。糖類：碳源可以提供合成新化合物所需的碳骨架，為呼吸作用提供底物與能源和滲透調(diào)節(jié)作用。VB1（硫胺素）VB1在體內(nèi)經(jīng)硫胺素激酶催化，可與ATP作用轉(zhuǎn)變成焦磷酸硫胺素（TPP）TPP是羧化輔酶，催化丙酮酸或α-酮戊二酸氧化脫酸。丙酮酸經(jīng)脫羧、脫氫生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)。因此VB1與糖代謝密切相關(guān)。最常用的碳源是蔗糖（分解產(chǎn)生葡萄糖和果糖）：為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架為細(xì)胞呼吸代謝提供底物，并產(chǎn)生能量保持培養(yǎng)基的滲透壓，使植物的細(xì)胞能正常吸收和代謝通過對(duì)20多種糖作為碳源對(duì)不同植物的愈傷組織形成和生長的研究表明，對(duì)多數(shù)植物組織來說蔗糖和葡萄糖是良好的碳源（呂芝香，1981）。一般情況下，低濃度（1.5-2.5%）的糖有利于木質(zhì)部的生長；高濃度（3-4%）的糖則促進(jìn)韌皮部的生長。若糖濃度居于兩者之間（2.5-3.5%），則同時(shí)對(duì)韌皮部和木質(zhì)部生長都有利。肌醇（環(huán)己六醇）與糖類物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化；形成植酸鈣鎂；形成磷脂，參與細(xì)胞膜的合成；形成果膠物質(zhì)，參與細(xì)胞壁構(gòu)建；促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。激素生長素類：促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和分裂、誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)生根，與一定量的細(xì)胞分裂素配合可誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生。細(xì)胞分裂素類：促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化不定芽、解除頂端優(yōu)勢而促進(jìn)側(cè)芽增殖、抑制離體組織或器官衰老等。其它生長調(diào)節(jié)劑：ABA(抑制胚胎的過早萌發(fā)，促進(jìn)胚胎的成熟)；GA(打破芽的休眠）；PP333（提高成苗的質(zhì)量）；油菜素內(nèi)脂（促進(jìn)生長，提高抗病性）；乙烯（促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大、果實(shí)成熟和器官脫落）等細(xì)胞分裂素的生理作用促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大胞質(zhì)分裂細(xì)胞擴(kuò)大誘導(dǎo)芽的分化生長素/細(xì)胞分裂素延緩葉片的衰老抑制核酸酶和蛋白酶的活性促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸瓊脂是一種從海藻中提取的高分子碳水化合物。在培養(yǎng)基中起凝固劑的作用，一般濃度為0.6%~1.0%,其凝固的性能與產(chǎn)品質(zhì)量、pH值有關(guān)。加熱時(shí)間過長和溫度過高均可能降低能夠性能。其它活性碳(ActivatedCarbon,AC):吸附作用，防止酚類導(dǎo)致的組織褐化；對(duì)一些植物的生根和形態(tài)發(fā)生和器官形成有促進(jìn)作用；使用濃度為0.02%~1.0%,常用濃度為0.1%~0.5%;多胺類物質(zhì)（polyamines):促進(jìn)生長和分化AgNO3:抑制乙烯的產(chǎn)生，一般濃度5~15mg.L-1AgNO3抗菌素：殺菌作用培養(yǎng)基分類根據(jù)無機(jī)鹽的濃度：高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基和高硝態(tài)氮培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基根據(jù)營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基配制為了實(shí)驗(yàn)的方便（不用每次都單獨(dú)稱量）和準(zhǔn)確（有些成分量太?。?，首先把各種營養(yǎng)元素配成母液：大量元素（合并配制）；微量元素（合并配制）；鈣鹽（氯化鈣）；鐵鹽（螯合鐵）；有機(jī)成分（分別配制）；生長調(diào)節(jié)劑（分別配制）。(2)微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成，微量元素用量較少，特別是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O，因此在配制中分微量I、微量II配制。按照表2，表3配方，用感應(yīng)量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量I(?)ml，微量II(?)ml。(3)鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液(?)ml。(4)有機(jī)母液的配制培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用電子分析天平，并儲(chǔ)存在棕色無菌瓶中。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。(5)植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度為0.2-1.0mg/ml，需要注意的是：配制生長素類，例如IAA、NAA、2，4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。細(xì)胞分裂素，如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加3-4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/L的鹽酸溶解，再用蒸餾水定容。GA3以95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌），保存在棕色試劑瓶中。注意：一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起混合后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再按一定順序放入母液中。用蒸餾水或重蒸餾水配制；藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純；藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確；先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。母液配好后貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，放入冰箱內(nèi)低溫保存（4℃），用時(shí)再按比例稀釋。貯備液使用前搖動(dòng)瓶子，如有沉淀、絮狀物、微生物污染應(yīng)停止使用。4、培養(yǎng)條件的選擇光照的影響光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間光量：光照強(qiáng)度光質(zhì)：光的波長溫度：一般采用25±2℃濕度：培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件；環(huán)境的濕度條件pH值：一般培養(yǎng)基要求5.8滲透壓：調(diào)節(jié)糖濃度氣體影響：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)第四章植物組織和器官培養(yǎng)一、植物細(xì)胞全能性的概念高等植物的器官和組織可以不斷分割至單個(gè)細(xì)胞。個(gè)體或組織、器官已經(jīng)分化的細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下具有再生成完整個(gè)體的遺傳潛能，稱為植物細(xì)胞全能性（Totipotency)。植物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均具有全能性實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的全能性需要一定的條件需要保持植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳信息的完整性高度退化的細(xì)胞不具有細(xì)胞全能性二、植物細(xì)胞分化所謂細(xì)胞分化（differentiation）：在個(gè)體發(fā)育中,細(xì)胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程。植物細(xì)胞分化的現(xiàn)象：藻類單細(xì)胞植物體無分化單細(xì)胞生物時(shí)間上的分化多細(xì)胞生物的分化細(xì)胞分化的本質(zhì)從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個(gè)處于不同時(shí)空條件下的細(xì)胞，基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的不同表現(xiàn)型。三、離體條件下植物細(xì)胞的分化脫分化（Dedifferentiation):已分化的細(xì)胞失去其分化特征，回復(fù)到分生組織狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài)的過程，稱為脫分化。再分化（Redifferentiation):已脫分化后的組織或細(xì)胞在一定的條件下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，經(jīng)過器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，進(jìn)一步發(fā)育成完整植株的過程，稱為細(xì)胞的再分化。細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)（一）細(xì)胞脫分化離體條件下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前（對(duì)單細(xì)胞來說）。靜止細(xì)胞啟動(dòng)分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。1、細(xì)胞脫分化的三個(gè)階段啟動(dòng)階段：表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；演變階段：細(xì)胞核開始向中央移動(dòng)，質(zhì)體演變成原質(zhì)體；終結(jié)階段，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。2、影響細(xì)胞脫分化的因素

a、生理或機(jī)械隔離損傷刺激損傷導(dǎo)致外植體產(chǎn)生生化反應(yīng)，如氣體交換律變化，呼吸活性的變化、酶活性的增加等。馬鈴薯、胡蘿卜和菊苣等儲(chǔ)藏組織受傷后在20~24h可達(dá)到最大的呼吸速度，故有人將其稱為“損傷呼吸”。b、培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性脫分化的實(shí)質(zhì)是使G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的過程。根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱：營養(yǎng)生長中心＞形成層＞薄壁組織＞厚壁組織＞特化細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱：頂端分生組織＞居間分生組織＞側(cè)生分生組織＞薄壁組織＞厚角組織＞輸導(dǎo)組織＞厚壁組織c、生長調(diào)節(jié)劑的影響生長素誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)蛋白，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)其它蛋白的活性。如：2，4-D誘導(dǎo)表達(dá)的基因par在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期的早期啟動(dòng)中具有功能性作用；NAA誘導(dǎo)PSK基因表達(dá)，PSKα可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。激素對(duì)細(xì)胞脫分化的調(diào)控涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。激素在植物生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，也是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。此外，在有些試驗(yàn)中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定的調(diào)節(jié)作用。d、光線的影響弱光下切取外植體，進(jìn)行暗培養(yǎng)，有利于細(xì)胞脫分化。外植體在DNA復(fù)制開始后，對(duì)光線表現(xiàn)則不敏感；在后續(xù)的培養(yǎng)期間，光線對(duì)生長也很少有刺激作用。3、細(xì)胞分裂與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，成功的脫分化必然導(dǎo)致細(xì)胞分裂。愈傷組織：植物細(xì)胞經(jīng)過脫分化和細(xì)胞增殖形成的無特定結(jié)構(gòu)和功能、無明顯極性、無次生細(xì)胞壁和胞間連絲的多細(xì)胞團(tuán)，稱為愈傷組織(callus/Calli)。愈傷組織培養(yǎng)過程：誘導(dǎo)期：細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期；分裂期：開始分裂并不斷增生子細(xì)胞；分化期：愈傷組織形成到器官發(fā)生時(shí)期。外植體由原來的靜止?fàn)顟B(tài)經(jīng)過誘導(dǎo)期的分裂準(zhǔn)備之后進(jìn)入分裂高峰，回復(fù)為分生狀態(tài)，這個(gè)過程即為脫分化。愈傷組織的形成是脫分化的細(xì)胞重新進(jìn)入活躍分裂的結(jié)果，但不是脫分化過程。對(duì)于單個(gè)細(xì)胞而言，分化細(xì)胞啟動(dòng)分裂發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后。特點(diǎn)：色澤鮮亮，結(jié)構(gòu)致密，表面有突起根據(jù)愈傷組織的形態(tài)特征，可以調(diào)整激素的配方：鮮嫩、致密和分生能力強(qiáng)的愈傷組織，說明激素培養(yǎng)條件合適；如果生長過于旺盛，質(zhì)地松軟，色澤亮麗，則可以降低生長素的水平；如果生長緩慢，結(jié)構(gòu)過密或過于松散，顏色暗淡/變黃，則可以考慮增加生長素的濃度。愈傷組織類型Ⅰ型：結(jié)構(gòu)緊密、堅(jiān)硬，不易分開，表面有條狀突起；Ⅱ型：介于Ⅰ型和Ⅲ型之間，結(jié)構(gòu)松散、易碎，有明顯的顆粒狀，白色或淡黃色；Ⅲ型：結(jié)構(gòu)松軟，水漬狀，白色透明或半透明。長期培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力喪失的原因解釋這種現(xiàn)象有三種假說：遺傳說：在培養(yǎng)細(xì)胞中的核的特性發(fā)生了改變，即細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變，導(dǎo)致形態(tài)不能發(fā)生。生理說：隨著培養(yǎng)繼代的反復(fù)進(jìn)行，被培養(yǎng)的組織或細(xì)胞中的內(nèi)源激素平衡關(guān)系可能會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致形態(tài)不能發(fā)生。競爭說：在復(fù)雜的多細(xì)胞外植體中，只有少數(shù)細(xì)胞能夠產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其余細(xì)胞都無法表達(dá)其全能性，如果非胚性的細(xì)胞類型在培養(yǎng)基中具有生長上的選擇優(yōu)勢，在反復(fù)的繼代培養(yǎng)中，非胚性細(xì)胞的群體將會(huì)逐步增大，而胚性細(xì)胞則逐漸減少，到了一定時(shí)期之后，在培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細(xì)胞，這時(shí)若想再恢復(fù)它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。注意：1、對(duì)愈傷組織形成過程的時(shí)期的劃分并不是絕對(duì)的，實(shí)際上分裂期和形成期往往可以出現(xiàn)在同一塊組織上；2、并不是所有的外植體細(xì)胞脫分化后都必然形成愈傷組織，一些外植體的細(xì)胞脫分化后可直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。3、理論上愈傷組織是可以無限制繼代的，但隨著繼代次數(shù)的增加，形態(tài)發(fā)生的能力將逐漸喪失。離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精作用，但經(jīng)歷了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷形胚和具子葉的胚軸階段），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。（二）培養(yǎng)細(xì)胞的再分化脫分化后的分生細(xì)胞在特定條件（離體培養(yǎng)）下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化的能力（形成愈傷組織或體細(xì)胞胚），并（愈傷組織）經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體（體細(xì)胞胚直接發(fā)育成新的植物個(gè)體），進(jìn)一步發(fā)育成完整生物體，這一個(gè)過程稱為細(xì)胞再分化。（書P61圖4-5）1、再分化過程愈傷組織再分化過程包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化遞進(jìn)進(jìn)行，最后再生成完整植株。細(xì)胞分化：細(xì)胞壁變厚、酶水平的變化、細(xì)胞機(jī)能分化等；組織分化：常見的是微管組織的分化；器官分化：又稱器官發(fā)生，分化的器官中最主要的是莖和根；植株再生：體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生2、細(xì)胞分化與極性的建立在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性（指植物的器官組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異）建立的標(biāo)志。極性建立后，生長素按極性方向流動(dòng)，導(dǎo)致維管成分的產(chǎn)生。3、影響細(xì)胞再分化的因素（1）激素在細(xì)胞分化中的調(diào)控作用：大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。即：生長素與細(xì)胞分裂素的比例小時(shí)則產(chǎn)生苗，比例大時(shí)則生根，而兩種激素的比例適中時(shí)，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。TE細(xì)胞分化：作為維管系統(tǒng)的主要成分，管狀分子（trachearyelements，TEs）在維管系統(tǒng)的形成中具有中心作用。在植物系統(tǒng)發(fā)育條件下，TEs由根和芽的原形成層或次生形成層細(xì)胞分化形成。在離體培養(yǎng)