孫克剛 《注射劑2008新法規(guī)解析及應(yīng)對(duì)方案系列培訓(xùn)班》

注射制劑無菌保證

工藝技術(shù)要求的探討《注射劑2008’新法規(guī)解析及應(yīng)對(duì)方案系列培訓(xùn)班》1注射制劑無菌保證工藝技術(shù)要求一、前言二、注射劑基本技術(shù)的要求三、無菌保證工藝研究與驗(yàn)證要求四、無菌藥品生產(chǎn)關(guān)鍵工藝的法規(guī)要求(以最終濕熱滅菌藥品工藝為例)2一、前言3

1970年~1975年，美國因輸液污染所導(dǎo)致的并發(fā)敗血癥事件有400多起，這在美國國內(nèi)引起強(qiáng)烈的反響。FDA從1975年開始進(jìn)行了深入、廣泛的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些事件并不是出于企業(yè)違規(guī)生產(chǎn)，而是整個(gè)生產(chǎn)體系中的不穩(wěn)定因素所致。此后，F(xiàn)DA于1976年首次將驗(yàn)證列入GMP。承認(rèn)在無保證系統(tǒng)中，過程控制優(yōu)于結(jié)果檢驗(yàn)。430多年過去了，注射劑染菌所致的藥難事件降臨我國，“欣弗”事件使得無菌制劑的無菌保障問題成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。

--------無菌檢查的局限性--------研究無菌保證的途徑5面臨的主要問題劑型選擇不合理無菌保證工藝選擇不合理無菌保證工藝研究不全面無菌保證工藝缺乏必要的驗(yàn)證GMP與發(fā)達(dá)國家要求還存在差距6《整頓和規(guī)范藥品研制、生產(chǎn)、流通秩序工作方案》（國食藥監(jiān)辦〔2006〕465號(hào)）要求:嚴(yán)格審評(píng)審批化學(xué)藥品注射劑、中藥注射劑和多組分生化注射劑等安全性風(fēng)險(xiǎn)較大的3類品種。7二、注射劑基本技術(shù)的要求8

審評(píng)審批要求:一、國家局已受理但尚未批準(zhǔn)注冊(cè)的化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑應(yīng)參照《技術(shù)要求》進(jìn)行研究。二、已經(jīng)批準(zhǔn)注冊(cè)的化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑也應(yīng)參照《技術(shù)要求》進(jìn)行相關(guān)研究，并在申報(bào)再注冊(cè)時(shí)提供相關(guān)研究資料。三、對(duì)已上市化學(xué)藥品注射劑、多組分生化藥注射劑進(jìn)行仿制、改變劑型或者改變給藥途徑研究時(shí)，研究者應(yīng)當(dāng)慎重考慮已上市品種的研究基礎(chǔ)。9以化學(xué)藥品注射劑為例:一、化學(xué)藥品注射劑劑型選擇的必要性、合理性二、化學(xué)藥品注射劑規(guī)格的合理性、必要性三、化學(xué)藥品注射劑原、輔料質(zhì)量控制及來源四、化學(xué)藥品注射劑處方及制備工藝合理性、可行性研究，特別是滅菌工藝的選擇及驗(yàn)證研究、工藝穩(wěn)定性研究等10五、化學(xué)藥品注射劑質(zhì)量研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂

六、化學(xué)藥品注射劑穩(wěn)定性研究

七、化學(xué)藥品注射劑非臨床安全性評(píng)價(jià)的技術(shù)要求

八、化學(xué)藥品注射劑臨床研究技術(shù)要求

九、仿制化學(xué)藥品注射劑的技術(shù)要求

十、化學(xué)藥品注射劑說明書和標(biāo)簽內(nèi)容的技術(shù)要求

11本講座主要探討無菌保證工藝研究及評(píng)價(jià)包括：制備工藝的選擇工藝參數(shù)的確定工藝的驗(yàn)證注射劑滅菌工藝及其驗(yàn)證12三、無菌保證工

藝研究與驗(yàn)證要求13最終滅菌產(chǎn)品的無菌保證水平規(guī)定為:微生物污染概率不超過百萬分之一采用無菌生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品:其無菌保證水平為微生物污染概率不超過千分之一

14與產(chǎn)品無菌保證相關(guān)的影響因素環(huán)境廠房、設(shè)備原材料（原輔料、包裝材料）無菌保證工藝生產(chǎn)過程控制人員衛(wèi)生15滅菌方法選擇按歐盟1999年8月正式開始執(zhí)行滅菌方法選擇的決策樹決策樹的作用是在考慮各種復(fù)雜因素的情況下輔助選擇最佳的滅菌方法凡是可以最終滅菌的產(chǎn)品務(wù)必要最終滅菌161718決策樹越往下，風(fēng)險(xiǎn)越大需要提供的必要證據(jù)越多19基本原則:無菌產(chǎn)品應(yīng)在灌裝到最終容器后進(jìn)行最終滅菌（首選）如因產(chǎn)品對(duì)熱不穩(wěn)定不能進(jìn)行最終滅菌時(shí)，可采用最終滅菌方法的替代方法----過濾除菌和/或無菌生產(chǎn)工藝（退而求其次）20同時(shí)明確如下要求：無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)，首先應(yīng)根據(jù)特定的處方選擇最佳的滅菌方法，然后再選擇包裝材料使用熱不穩(wěn)定的包裝材料不能作為選擇無菌生產(chǎn)工藝的理由因其他因素選擇的包裝容器不能進(jìn)行最終滅菌，藥品生產(chǎn)企業(yè)仍有責(zé)任不斷尋找可接受的替代容器，使得產(chǎn)品可以在可接受的時(shí)間范圍內(nèi)采用最終滅菌的方法任何商業(yè)考慮均不能作為不使用具有最高無菌保證水平的最終滅菌方法的理由21常用的滅菌方式及其無菌保證水平1、過度殺滅法微生物殘存概率＜10-62、殘存概率法微生物殘存概率＜10-63、無菌生產(chǎn)工藝無菌保證一般只能達(dá)到10-3水平22最終滅菌工藝的驗(yàn)證要求最終滅菌工藝：過度殺滅法（Fo≥12）殘存概率法（8≤Fo＜12）目標(biāo)：滅菌后的微生物殘存概率＜10-623過度殺滅設(shè)計(jì)方法：一種滅菌設(shè)計(jì)方法，只需要最少的關(guān)于產(chǎn)品生物負(fù)載的信息。最差條件的生物負(fù)載猜測(cè)用來確定所產(chǎn)生的殺滅力需要獲得滅菌物上的PNSU為10-6。在使用這個(gè)方法時(shí)，確效計(jì)劃必須證明FBIO和FPHY都大于12分鐘。24殘存概率法：一種滅菌設(shè)計(jì)方法，當(dāng)所產(chǎn)生的殺滅力需要達(dá)到PNSU為10-6時(shí)，以（滅菌物品上或內(nèi)的）生物負(fù)載的特性和產(chǎn)品對(duì)熱的敏感度為基礎(chǔ)。應(yīng)產(chǎn)品而定的設(shè)計(jì)方法25工藝驗(yàn)證要求：過度殺滅法和殘存概率法均應(yīng)進(jìn)行工藝驗(yàn)證驗(yàn)證內(nèi)容：空載熱分布滿載熱分布熱穿透試驗(yàn)微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)（殘存概率法）滅菌前微生物污染水平---數(shù)量和耐熱性---過程控制26熱力滅菌的動(dòng)力學(xué)原理微生物耐熱參數(shù)——（D值）溫度系數(shù)——Z值FT值——T℃滅菌時(shí)間F0值——標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間無菌保證值（SAL）滅菌率L27對(duì)數(shù)規(guī)則：Arrhenius質(zhì)量作用定律濕熱滅菌的對(duì)數(shù)規(guī)則始于1921年Bigeow發(fā)表的論文---用對(duì)數(shù)規(guī)則闡述滅菌工藝過程，他認(rèn)為，滅菌過程可以用阿倫尼烏斯的一級(jí)反應(yīng)式來描述。根據(jù)質(zhì)量作用定律，在恒定溫度及保持其它條件不變的情況下，單位時(shí)間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于t0時(shí)原有的數(shù)目，即：dN/dt＝K(N0－Nk)式中：N0為t＝0時(shí)，存活的微生物數(shù)；Nk為t時(shí)被殺滅的微生物數(shù)；N為t時(shí)存活的微生物數(shù)。由此得出，滅菌時(shí)微生物的死亡遵循對(duì)數(shù)規(guī)則。28微生物存活數(shù)與滅菌時(shí)間關(guān)系圖

半對(duì)數(shù)座標(biāo)Y軸：微生物取對(duì)數(shù)X軸：時(shí)間為10進(jìn)制普通座標(biāo)Y軸及X軸均為普通座標(biāo)tlgN102030123tN10203012329微生物滅活曲線紅色為理想狀態(tài)：直線自然界存在的芽孢可能為A、B、C生物指示劑測(cè)試的線性較好LgNtABC生物指示劑30微生物耐熱參數(shù)（D值）:D值是指在特定滅菌條件下，使微生物數(shù)量下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位或殺滅90%所需要的時(shí)間（分鐘）。31D-值：在基本溫度時(shí)使微生物數(shù)量下降一個(gè)對(duì)數(shù)值（或90%）所需的時(shí)間32滅菌溫度系數(shù)（Z值）:Z值系指使某一種微生物的D值變化一個(gè)對(duì)數(shù)單位，滅菌溫度應(yīng)升高或下降的度數(shù).在沒有特定要求時(shí):濕熱滅菌條件下Z值通常取10℃；干熱滅菌條件下Z值通常取20℃；干熱去熱原時(shí)Z值通常取54℃。3334

FT值——T(℃):滅菌時(shí)間FT值指T(℃)滅菌值，系指一個(gè)給定Z值下，滅菌程序在溫度T(℃)下的等效滅菌時(shí)間。FT＝DT×ΔlgN式中:DT為在T(℃)下微生物的D值；ΔlgN為T(℃)下滅菌程序使微生物數(shù)下降的對(duì)數(shù)單位數(shù)。35F0值:標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間（用于濕熱滅菌），系滅菌過程賦予待滅菌物品在121℃下的等效滅菌時(shí)間（分鐘）。FH值:標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間（用于干熱滅菌），系滅菌過程賦予待滅菌物品在170℃下的等效滅菌時(shí)間（分鐘）。36滅菌率L：L指在某一溫度T(℃)下滅菌lmin所獲得的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間。L=10(Ti-TR)/Z

Ti——滅菌溫度TR——標(biāo)準(zhǔn)參照溫度Z——微生物死亡率常數(shù)3738時(shí)間溫度致死率濕熱滅菌的致死率39無菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證要求無菌生產(chǎn)工藝：過濾除菌＋無菌生產(chǎn)工藝無菌組裝工藝40工藝驗(yàn)證要求：---培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)系統(tǒng)的驗(yàn)證---除菌過濾系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)包括過濾系統(tǒng)相容性測(cè)試、過濾前后濾膜完整性測(cè)試、濾膜的微生物截留量測(cè)試41微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)42微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

生物指示劑--簡稱為BI（biologicalindicator）:是對(duì)特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測(cè)定滅菌效力的微生物制劑，適用于制備生物指示劑的微生物多為芽胞類細(xì)菌，這是因?yàn)?，除輻射滅菌外，芽胞類?xì)菌比常規(guī)的生長態(tài)微生物對(duì)滅菌工藝具有更強(qiáng)的耐受性。生物指示劑既可用來測(cè)定一個(gè)給定的滅菌工藝條件的滅菌效果，也可判別它是否符合無菌保證要求。43微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

所謂濕熱滅菌工藝的生物指示劑微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)，系指將一定量已知D值的耐熱孢子接入被滅菌的產(chǎn)品中，在設(shè)定的濕熱滅菌條件下滅菌，以驗(yàn)證設(shè)定的滅菌工藝是否確實(shí)能賦予產(chǎn)品所需的SAL為10－6而進(jìn)行的試驗(yàn)及評(píng)價(jià)過程。44微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

USP和BP對(duì)這方面有專門的論述。一般說來，對(duì)生物指示劑選擇的原則性要求是：——孢子（菌株）穩(wěn)定——耐熱性強(qiáng)于被滅菌物品中常見的污染菌——系非致病菌——易于培養(yǎng)，孢子萌發(fā)率要在90%以上——有效期長——保存及使用方便——安全性好45微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

濕熱滅菌工藝驗(yàn)證用生物指示劑的來源主要有兩類:一類是采用標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑，這類生物指示劑可從市場(chǎng)購買；另一類需用從日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控分離出的最耐熱微生物孢子制備，并測(cè)得相關(guān)參數(shù)（最佳生長條件、耐熱性等）后方可使用。46菌種名稱常規(guī)D121℃值/min嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillusstereathernophilus1.5～3.0枯草芽胞桿菌BacillussubtilisATCC52300.3～0.7凝結(jié)芽胞桿菌Bacilluscoagulans0.4～0.8梭狀芽胞桿菌Clostridiumsporogenes0.4～0.8濕熱滅菌工藝驗(yàn)證中常用的生物指示劑47例:國產(chǎn)非治病性嗜熱肪芽胞菌芽胞（ATCC7953）D值-------------D121值1.74存活時(shí)間------121oC飽和蒸汽下,存活時(shí)間不少于3.9分鐘死亡時(shí)間------121oC飽和蒸汽下,死亡時(shí)間不少于19分鐘孢子量----------5×105-6cfu/支48使用方法:將生物指示劑和被滅菌物品一起放置在滅菌柜（鍋）內(nèi)，上、中層、中央和排氣口（冷點(diǎn)處）滅菌后取出，然后直接置于56–60oC培養(yǎng)24–48小時(shí)，并另取一支未經(jīng)滅菌生物指示劑一起培養(yǎng)，作為陽性對(duì)照。結(jié)果判斷:根據(jù)顏色判斷滅菌效果，培養(yǎng)后全部保持紫色滅菌合格。若由紫色變?yōu)辄S色判為滅菌不合格。對(duì)照管應(yīng)紫變黃色為該指示劑有效。49例:進(jìn)口3MTMATTESTTM(1262)蒸汽滅菌生物培養(yǎng)指示劑(嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片)在121℃飽和蒸汽條件下，存活時(shí)間大于或等于5分鐘，殺滅時(shí)間小于或等于15分鐘。滅菌完畢，取出生物指示劑后至少冷卻10分鐘以上，方可擠破生物指示劑內(nèi)安瓿。否則有可能導(dǎo)致安瓿的碎片傷人。只有對(duì)照管為陽性，其生物結(jié)果才算有效。50使用方法1、將壓力蒸汽滅菌生物培養(yǎng)指示劑放于一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試包中；2、按照國家規(guī)范，分別將測(cè)試包放于鍋內(nèi)不同位置；3、滅菌完畢，取出生物指示劑；4、擠破內(nèi)含的安瓿，與一支對(duì)照管一起放于56℃培養(yǎng)鍋培養(yǎng)；5、48小時(shí)后，閱讀結(jié)果。51微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)挑戰(zhàn)試驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑的選用應(yīng)構(gòu)成挑戰(zhàn)性的必要條件：可用藥典，如USP<1035>中規(guī)定的生物指示劑；對(duì)存活概率滅菌程序的產(chǎn)品而言，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，所用生物指示劑的耐熱性應(yīng)大于產(chǎn)品中常見污染菌的耐熱性，生物指示劑的用量也應(yīng)大于產(chǎn)品中該污染菌的水平。經(jīng)生物指示劑驗(yàn)證后，應(yīng)能證明在設(shè)定的F0條件下，產(chǎn)品的無菌保證水平低于10-6。52微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)方案制訂制訂驗(yàn)證方案時(shí)，應(yīng)當(dāng)綜合考慮相關(guān)法規(guī)要求、滅菌熱分布及熱穿透試驗(yàn)數(shù)據(jù)、產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性、日常生產(chǎn)監(jiān)控中所獲得的滅菌前產(chǎn)品中的微生物污染水平和污染菌的耐熱性數(shù)據(jù)。方案還包括驗(yàn)證記錄的各種表格。53微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)濕熱滅菌程序通常分為兩類：過度殺滅程序（OverkillDesignApproach）

殘存概率程序（Product-SpecificDesignApproach）54微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)挑戰(zhàn)試驗(yàn)(生物指示劑驗(yàn)證試驗(yàn)):生物指示劑的裝載滅菌檢查和培養(yǎng)結(jié)果評(píng)價(jià)驗(yàn)證試驗(yàn)的頻率

55微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

作為一項(xiàng)生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，盡管生物指示劑驗(yàn)證不能替代物理驗(yàn)證，但它能如實(shí)反映滅菌工藝條件對(duì)微生物的殺滅效果，從而證明該滅菌工藝所賦予相關(guān)產(chǎn)品的無菌保證水平是否符合要求。生產(chǎn)指示劑在試驗(yàn)中扮演了各種可能因素造成的產(chǎn)品中的“污染菌”的角色，以這種方式進(jìn)行的驗(yàn)證更切合實(shí)際，更能說明所設(shè)定的滅菌程序是否安全。56微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

對(duì)熱穩(wěn)定性很好的產(chǎn)品而言，通常采用過度殺滅程序，該程序能賦予產(chǎn)品足夠大的安全系數(shù)，使在121℃下D值約為1.0min的細(xì)菌孢子至少下降12個(gè)對(duì)數(shù)單位。在過度殺滅程序的一半時(shí)間時(shí)，可使該孢子至少下降6個(gè)對(duì)數(shù)單位。由于殺滅微生物孢子（生物指示劑）的滅菌條件極為苛刻，因此，從滅菌程序的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間F0來看，毋須擔(dān)心產(chǎn)品滅菌后的無菌保證問題。57微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

并不是所有的滅菌程序都可進(jìn)行生物指示劑驗(yàn)證。有些產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性相當(dāng)差，滅菌溫度僅能控制在100℃左右，整個(gè)滅菌程序的F0值還不到1min，對(duì)此類程序進(jìn)行生物指示劑驗(yàn)證就沒有太多的意義。此類產(chǎn)品的無菌保證水平主要是通過無菌生產(chǎn)工藝來實(shí)現(xiàn)，滅菌僅能作為提高產(chǎn)品無菌保證水平的手段。58微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)

WHOGMP中強(qiáng)