生物化學實驗參考答案

《生物化學實驗Ⅰ》總復習思考題部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鑒請酌情考慮，后果自負?！巫?.請掌握下列生物化學實驗常用儀器的正確操作使用方法，并能回答以下問題：（1）離心機使用時為什么要平衡？普通離心機與高速離心機在平衡時有什么不同要求？平衡是為了讓轉動物體重心正好在轉軸上，如果不在，會對轉軸產生很大作用力，有時整臺機器會跟著晃動。這對機器損耗很大。轉速越高的離心機不光重量很重，使用時還要特別放平衡，就連離心管里面的試液都要放置等量，離心管還要對稱放入轉子試管孔內，以確保轉子平衡運行，而且在調節(jié)轉速時，還要使用分段升速法。(2)為什么用高速組織搗碎機進行動、植物組織搗碎時，需采用間歇式方式進行操作？為了防止產熱過高，破壞組織內的蛋白質。防止蛋白變性。(3)用真空泵進行減壓抽濾時，為什么要連接緩沖瓶？防止負壓產生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，進入濾瓶中，污染濾液。為什么肝糖元只能從剛宰殺的動物肝臟中獲?。吭谔崛「翁窃^程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解產物中如果存在提取中殘留蛋白質時，在用班氏試劑檢測水解產物，有什么影響！動物死亡后，體內的細胞還能存活一段時間，由于進行細胞呼吸作用，肝細胞會消耗肝糖元，所以必須用新鮮的肝臟細胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白質能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏試劑使用時需要加熱，而加熱會時殘留的蛋白質變性水解，對最終測得的水解產物顏色可能有影響。（水解的產生的氨氣結合銅離子，是銅離子的氧化性失去，導致生產絳藍色沉淀，實驗將失?。┱堦U述分光光度儀的主要部件及其功能；闡述紫外與可見光的光波長范圍；在紫外與可見光范圍內測定物質吸光度時，對光源與吸收池有何要求？光電管的功能是什么？為什么說光電管是分光光度儀最脆弱和最易損的部件？光源（鎢燈）：發(fā)光。單色器：把混合光波分解為單一波長光的裝置。吸收池：盛放待測流體（液體、氣體）試樣的容器。該容器應具有兩面互相平行、透光且有精確厚度的平面。它藉助機械操作能把待測試樣間斷或連續(xù)地送到光路中，以便吸收測量的輻射（光）通量。檢測器：將單色器分出的光信號進行光電轉換，電信號在工作站顯示成出峰。測量裝置：通過測得的電流表·記錄器·數(shù)字示值讀書單元的數(shù)據(jù)來繪制吸收曲線。紫外光：200至350nm可見光波長:350至760nm紫外測定：其應用波長范圍為200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光區(qū)工作時，必須采用石英池或熔凝石英池?？梢姽鉁y定：用波長為400～850nm的可見光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。光電管的功能：光電轉換，將光信號轉化成電信號。光電管容易產生光電管疲勞：所以不測定時必須將試樣室蓋蓋好，使光路切斷，以延長光電管的使用壽命。

請闡述Beer-Lamber定律，并用該定律闡述分光光度儀工作原理？用分光光度儀定制某物質標準曲線時，需將OD值測定范圍確定在0.2～0.8區(qū)域內，為什么？（這題沒找到答案，自己寫的）朗伯(Lambert)定律闡述為：光被透明介質吸收的比例與入射光的強度無關；在光程上每等厚層介質吸收相同比例值的光。比爾(Beer)定律闡述為：光被吸收的量正比于光程中產生光吸收的分子數(shù)目。log(Io/I)=εCl(1—4)式中Io和I分別為入射光及通過樣品后的透射光強度；log（Io/I）稱為吸光度(ab—sorbance)舊稱光密度(opticaldensity)；C為樣品濃度；l為光程；ε為光被吸收的比例系數(shù)。當濃度采用摩爾濃度時，ε為摩爾吸收系數(shù)。它與吸收物質的性質及入射光的波長λ有關。工作原理：通過測得的吸光度，帶入Beer-Lamber定律，可以求得該物質的濃度；通過確定該物質的最大吸收波長，可以確定該物質的種類。OD值小于0.2時，底物濃度低，誤差大；OD值大于1時，線性關系不好，所以取0.2到0.8.可以用來進行分析測定用的標準品應具備哪些特性？普通性，純度高（工業(yè)純，化學成分單一，分析純，光譜純，食品純），理化性質穩(wěn)定，含量準確，雜質無影響。請闡述移液管與比色皿的正確清洗方法和放置方法；闡述移液管取樣與比色皿加樣的正確操作方式和操作注意事項。移液管：移液管清洗要根據(jù)吸取液體的性質選用不同的清洗劑，有機液體可用丙酮、乙醇溶液，無機試劑可用洗滌劑。應反復清洗數(shù)次，再用蒸餾水清洗干凈，自然涼干。標志：內壁不掛水珠。干凈的移液管應置于干凈的一夜管架上，先豎著放，等水分干后橫著放。比色皿：用鉻酸侵泡一段時間后，將鉻酸倒回試劑瓶，再用清水沖洗比色皿。使用時，要讓光穿過透光面，測定完畢放到盒里時要讓磨砂面向上，清洗后放置時，倒置于濾紙上。移液管取樣：根據(jù)所移溶液的體積和要求選擇合適規(guī)格的移液管使用，在滴定分析中準確移取溶液一般使用移液管，反應需控制試液加入量時一般使用吸量管。檢查移液管的管口和尖嘴有無破損，若有破損則不能使用;1、使用前：使用移液管，首先要看一下移液管標記、準確度等級、刻度標線位置等。使用移液管前，應先用鉻酸洗液潤洗，以除去管內壁的油污。然后用自來水沖洗殘留的洗液，再用蒸餾水洗凈。洗凈后的移液管內壁應不掛水珠。移取溶液前，應先用濾紙將移液管末端內外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2至3次，以確保所移取溶液的濃度不變。2、吸液：搖勻待吸溶液，將待吸溶液倒一小部分于一洗凈并干燥的小燒杯中，用濾紙將清洗過的移液管尖端內外的水分吸干，并插入小燒杯中吸取溶液，當吸至移液管容量的1/3時，立即用右手食指按住管口，取出，橫持并轉動移液管，使溶液流遍全管內壁，將溶液從下端尖口處排入廢液杯內。如此操作，潤洗了3-4次后即可吸取溶液。將用待吸液潤洗過的移液管插入待吸液面下1～2cm處用吸耳球按上述操作方法吸取溶液(注意移液管插入溶液不能太深，并要邊吸邊往下插入，始終保持此深度)。當管內液面上升至標線以上約1～2cm處時，迅速用右手食指堵住管口(此時若溶液下落至標線以下，應重新吸取)，將移液管提出待吸液面，并使管尖端接觸待吸液容器內壁片刻后提起，用濾紙擦干移液管或吸量管下端粘附的少量溶液。(在移動移液管或吸量管時，應將移液管或吸量管保持垂直，不能傾斜)3、調節(jié)液面：左手另取一干凈小燒杯，將移液管管尖緊靠小燒杯內壁，小燒杯保持傾斜，使移液管保持垂直，刻度線和視線保持水平(左手不能接觸移液管)。稍稍松開食指(可微微轉動移液管或吸量管)，使管內溶液慢慢從下口流出，液面將至刻度線時，按緊右手食指，停頓片刻，再按上法將溶液的彎月面底線請闡述茚三酮反應的反應原理及其應用。書93頁請闡述蛋白質“鹽析”與“中性有機溶劑沉淀蛋白質”反應原理；這兩類沉淀反應有何應用？鹽析：用大量中性鹽使蛋白質從其膠體溶液中析出的過程為蛋白質的鹽析作用。應用：分級分離，提純蛋白質。中性有機溶劑：有機溶劑有強合水作用，使蛋白質分子脫水，破壞蛋白質的水化層，降低其在水溶液中的穩(wěn)定性，而形成沉淀。應用：提純蛋白質。在蛋白質不可逆沉淀反應實驗中，多次涉及到蛋白質遇到沉淀劑后，沉淀不增加反而消失的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象統(tǒng)稱為“假溶”現(xiàn)象，蛋白質的“假溶”與“復溶”兩者之間有什么本質上的不同？并請解釋以下“假溶”現(xiàn)象：假溶指蛋白質已變性后，因溶液或酸或堿而帶同種電荷，使蛋白質分子間產生排斥，從而溶解。復溶指蛋白質因溶液酸堿度，輕金屬離子等一起溶解度降低的現(xiàn)像，在消除這些因素后，蛋白質能回到原樣從而復溶。此過程蛋白質未變性。在重金屬鹽沉淀蛋白質實驗中，加入過量的硫酸銅或過量的乙酸鉛后，沉淀消失現(xiàn)象？過量的硫酸銅（醋酸鉛）中的銅（鉛）離子會吸附在蛋白質表面從而使蛋白質帶電而是蛋白質分子間相互排斥，最終發(fā)生假溶現(xiàn)象。在“海倫壓環(huán)”試驗中；請解釋用濃硫酸與濃鹽酸進行海倫壓環(huán)試驗振蕩后，沉淀消失現(xiàn)象？濃硫酸和濃鹽酸中含有大量的氫離子，氫離子吸附在蛋白質表面使蛋白質帶電，也能發(fā)生假溶現(xiàn)象。請闡述用透析試驗驗證蛋白質“可逆”與“不可逆沉淀反應”的實驗設計原理。書101。透析法：透析袋能使小分子運動出去，而大分子蛋白質不能。若果透析后蛋白質復性則為可逆沉淀，未復性則為不可逆。請闡述酸、堿、鹽的存在對加熱變性蛋白質沉淀反應有何影響。要求能對加熱變性沉淀蛋白質實驗中涉及到的每個實驗現(xiàn)象作出正確的理論解釋。沉淀——溶解，解釋：參照假溶現(xiàn)象。請闡述電泳基本概念，常用電泳方法的分類及其應用。書32.請闡述全血，血漿與血清基本概念。略請闡述人體血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理，通過人體血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳，可以將人體血清蛋白分為哪幾類？分離測定各血清蛋白相對百分含量對于醫(yī)學臨床診斷疾病有何指導意義？書13127.為什么人體血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳適宜在pH=8.6的弱堿性緩沖液中進行電泳分離，而不適宜在弱酸性緩沖液中電泳？書131頁，實驗原理第二段。請闡述在電泳實驗中，電場強度、電泳緩沖溶液pH、緩沖溶液的離子強度對被分離物質有何影響?電場強度：電泳速度緩沖液PH：蛋白質帶電多少，從而影響電泳速度。緩沖液離子強度：溶液的離子強度電泳液中的離子濃度增加時會引起質點遷移率的降低。其原因是帶電質點吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個與運動質點符合相反的離子氛（ionicatmosphere），離子氛不僅降低質點的帶電量，同時增加質點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響質點的帶電量，改變泳動速度。離子的這種障礙效應與其濃度和價數(shù)相關?？捎秒x子強度I表示。

在電泳中“虹吸現(xiàn)象”是如何發(fā)生的？“虹吸現(xiàn)象”對電泳有何影響？如何在電泳實驗操作中盡量避免“虹吸現(xiàn)象”發(fā)生？虹吸現(xiàn)象是液態(tài)分子間引力與位差能造成的。（如薄膜的干濕程度不同，點樣時操作不精確，電泳時薄膜未平衡等）影響：在某區(qū)域發(fā)生虹吸現(xiàn)象會使這里電泳時蛋白質分子在電場中運動速度改變，從而時薄膜上的蛋白質分布不均勻準確，影響測量結果。挑選薄膜是一定要挑光滑，質地均勻，無斑點，能迅速潤濕的。點樣精確均勻，并且架空式不能使薄膜接觸桌面。電泳之前一定要平衡。列表詳盡闡述在血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗操作中，下列試劑及器材的作用：三層濾紙（作鹽橋）；（2）厚型載玻片（架空，使薄膜點樣懸空）；pH8.6的電泳緩沖液（時蛋白質帶同種電荷）；（4）10B氨基黑染色液（固定染色蛋白質）；（5）冰乙酸-乙醇漂洗液（洗去薄膜上不含蛋白質的染料）（6）0.4moL/L的NaOH溶液（洗去蛋白質上的染料）？請闡述Folin酚法定制蛋白質標準曲線的原理；對比雙縮脲定制蛋白質標準曲線原理和方法，列表從標準品的使用濃度，測定范圍，反應靈敏度，標準品的用量，線性關系的好壞比較兩種測定蛋白質方法的優(yōu)、缺點。（略）請闡述考馬斯亮藍G250染色法定制蛋白質標準曲線的原理；對比Folin酚定制蛋白質標準曲線原理和方法，列表從標準品的使用濃度，測定范圍，反應靈敏度，標準品的用量，線性關系的好壞比較兩種測定蛋白質方法的優(yōu)、缺點。（略）請從檢測方法的原理與應用范圍著手分析，為什么分別采用Folin酚法和雙縮脲法測定“蛋白胨”這種微生物培養(yǎng)基質中蛋白含量時，其測定出的蛋白含量檢測結果會大相徑庭，相差甚遠？從測定特點去分析，一個能測定水解蛋白，一個不能。相關資料：蛋白胨是有機化合物。蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白質經酸、堿或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃內蛋白質的初步消化產物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，在抗生素、醫(yī)藥工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生化制品及微生物學科研等領域中的用量均很大，可以用來治療消化道疾??；不同的生物體需要特定的氨基酸和多肽，因此存在著各種蛋白胨，一般來說，用于蛋白胨生產的蛋白包括動物蛋白（酪蛋白、肉類）和植物蛋白（豆類）等兩種。在考馬斯亮藍G250染色法定制蛋白質標準曲線實驗準備中，考馬斯亮藍G250試劑配制中往往因試劑的酸度、試劑過濾的清澈度、試劑質量本身等諸多因素，影響試劑配制的準確性。從而直接影響其標準曲線定制的準確性，因此常常需要對配制好的試劑進行準確度測定，請你結合該方法的檢測靈敏度，闡述驗證試劑配制準確性的有效檢測方法。（以實例進行闡述）根據(jù)：在測定液中含5ug/ml時就有0.275的吸光度變化。從不同濃度（等差關系）的蛋白質對應的吸光度（等差關系）比較，可以設計檢測方法。測定食品中蛋白質含量的傳統(tǒng)方法是什么？請闡述該方法的檢測原理。三聚氰胺事件發(fā)生后，該檢測方法暴露出了一個重大缺陷，請分析導致該缺陷的原因，并根據(jù)你所學知識，推薦一種測定食品中蛋白含量的準確方法，并說明其方法在實際應用中的優(yōu)點。略，書118頁。為什么在提取唾液淀粉酶前，必需將口中的殘渣用清水漱盡后，才能滿足實驗需要，正確提取淀粉酶？否則會對酶的什么驗證實驗造成