第十一章-生物素

第十一章-生物素第一頁(yè)，共28頁(yè)。第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記第一節(jié)生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

一、活化生物素

二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第一頁(yè)第二頁(yè)，共28頁(yè)。第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)

一、靈敏度二、特異性

三、穩(wěn)定性四、適用性

五、其他思考題小結(jié)第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用

一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理

二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用

三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用

四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用

五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第二頁(yè)第三頁(yè)，共28頁(yè)。維生素H動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高M(jìn)W244.31kD.I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記第三頁(yè)第四頁(yè)，共28頁(yè)。一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)第四頁(yè)第五頁(yè)，共28頁(yè)。生物素活化活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標(biāo)記核酸的活化生物素第五頁(yè)第六頁(yè)，共28頁(yè)。活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS適用標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì)生物素N-羥基丁二酰胺碳二亞胺生物素羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）如何減小空間位阻？長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離第六頁(yè)第七頁(yè)，共28頁(yè)。標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)記氨基第七頁(yè)第八頁(yè)，共28頁(yè)。標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素第八頁(yè)第九頁(yè)，共28頁(yè)。標(biāo)記核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷慊趸剑芍苯优c腺嘌呤氨基結(jié)合,形成B-核酸探針

第九頁(yè)第十頁(yè)，共28頁(yè)。生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ

可直接標(biāo)記核酸，但對(duì)堿基配對(duì)有影響。第十頁(yè)第十一頁(yè)，共28頁(yè)?；罨锼赝ㄟ^側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記－多價(jià)性；對(duì)BNHS多標(biāo)記抗體,BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后活性將降低；二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第十一頁(yè)第十二頁(yè)，共28頁(yè)。選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應(yīng)用濃度0.5~5μg/ml;生物素1~3個(gè)/Ag，3~5個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力第十二頁(yè)第十三頁(yè)，共28頁(yè)。第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。第十三頁(yè)第十四頁(yè)，共28頁(yè)。結(jié)構(gòu)

四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基PI

10.56結(jié)合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性13～1515～18親合素（A）鏈霉親合素(SA)一、理化特性第十四頁(yè)第十五頁(yè)，共28頁(yè)。二、親合素/鏈霉親合素標(biāo)記標(biāo)記物：酶、膠體金

異硫氰酸熒光素（FITC）HRP-AV(SA)過碘酸鈉、戊二醛ABC/SABC預(yù)制AV(SAV)-Biotin第十五頁(yè)第十六頁(yè)，共28頁(yè)。第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他第十六頁(yè)第十七頁(yè)，共28頁(yè)。第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。第十七頁(yè)第十八頁(yè)，共28頁(yè)。一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特點(diǎn)：以游離A分別連接B-Ab和B-E第十八頁(yè)第十九頁(yè)，共28頁(yè)。BA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A-B·E特點(diǎn)：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省卻了加B-E的步驟第十九頁(yè)第二十頁(yè)，共28頁(yè)。3.

ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC第二十頁(yè)第二十一頁(yè)，共28頁(yè)。二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測(cè)定

第二十一頁(yè)第二十二頁(yè)，共28頁(yè)。三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常采用BA法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。

第二十二頁(yè)第二十三頁(yè)，共28頁(yè)。四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離第二十三頁(yè)第二十四頁(yè)，共28頁(yè)。五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè)用BAS制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測(cè)第二十四頁(yè)第二十五頁(yè)，共28頁(yè)。思考題生物素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？生物素通過什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)？親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點(diǎn)？為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用？親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標(biāo)記？為什么生物素－親合素系統(tǒng)具有放大作用？生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同？生物素－親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過程還是單一檢測(cè)信號(hào)的能量？生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標(biāo)記免疫技術(shù)聯(lián)接？如何將生物素－鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點(diǎn)ELISA?第二十五頁(yè)第二十六頁(yè)，共28頁(yè)。小結(jié)生物素—親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級(jí)放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測(cè)定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物