基因敲除新技術(shù)

ZFN技術(shù)原理鋅指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè)α螺旋可以特異識(shí)別3-4個(gè)堿基；人工設(shè)計(jì)識(shí)別特異DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個(gè)X來實(shí)現(xiàn)識(shí)別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對(duì)人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。ZFN技術(shù)鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識(shí)別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識(shí)別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。嶄新的技術(shù)-TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn)–染色體DNA序列的人工編輯修改（點(diǎn)）突變：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）片段刪除片段插入目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn)靶向基因技術(shù)經(jīng)典方法：自殺質(zhì)粒，同源重組–幾率低(~1HReventper106cells），難！飽含希望與失望的技術(shù)：ZFN，被Sigma公司壟斷新的里程碑：TALENTALEN技術(shù)基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對(duì)象。技術(shù)原理：表達(dá)一個(gè)重組核酸酶，在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識(shí)別靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過程。1989年植物病原體黃單胞菌屬（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。2007年發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列與核酸靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯由34個(gè)aa組成一個(gè)單元模塊，重復(fù)17-18次34個(gè)aa中的第12和13個(gè)氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)對(duì)應(yīng)識(shí)別一個(gè)目標(biāo)堿基

TALEN發(fā)展過程人工構(gòu)建TALE模塊識(shí)別指定核酸序列102堿基模塊單元……14–18個(gè)重復(fù)真核表達(dá)……14–18個(gè)重復(fù)特異識(shí)別指定的14-18個(gè)核酸序列并與之結(jié)合34氨基酸單元TALEN發(fā)展過程TALEN(TALE+FOKI)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)TALEN基因敲除X2TALEN表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染、表達(dá)切割靶位點(diǎn)切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體TALEN介導(dǎo)的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級(jí)DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm點(diǎn)突變片段刪除基因敲入2011年8月，NatureBiotechnology上同時(shí)發(fā)表了用TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。一篇人類干細(xì)胞《GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases》

一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》

兩篇斑馬魚《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》

一篇綜述《MoveoverZFN》TALEN的最前沿TALEN靶向（基因敲除）技術(shù)

基本流程選擇、確定靶點(diǎn)2.TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建3.TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建4.TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá)TALEN重組蛋白5.檢測(cè)突變效率，篩選（移碼）突變體X2X2X2靶點(diǎn)的DNA序列特征：相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn)參考文獻(xiàn)：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件：/node/add/talef-off/選擇確定TALE靶點(diǎn)

TAL的核酸識(shí)別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD）

RVD與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G，非常簡單明確欲使TALEN特異識(shí)別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14-18個(gè)）串聯(lián)克隆即可。TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)步驟一：靶點(diǎn)識(shí)別單元串聯(lián)步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)將靶點(diǎn)識(shí)別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14-18個(gè)堿基）分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。X2真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對(duì)步驟三.將TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合。此時(shí)，兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因。FOKI內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū)內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。突變體形成PCR–酶切法利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-I核酸酶檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：>=2%可用，>=10%很好TALEN切割效率檢測(cè)TALEN切割效率檢測(cè)啟動(dòng)子–ABCDEF–stop-Target

site-DEFHIJK啟動(dòng)子–ABCDEFHIJK共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測(cè)質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒1+TALEN質(zhì)粒2熒光素酶檢測(cè)法發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)1.5至2倍即可有效獲得突變體。突變體篩選

有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆

PCR-酶切法鑒定

PCR測(cè)序確認(rèn)基本工具質(zhì)粒14–18bp靶點(diǎn)序列怎樣做TALEN1單元模塊質(zhì)粒：A，G，C,T共4種2單元模塊質(zhì)粒：4X4=16種TALEN表達(dá)載體：基于PCS2質(zhì)粒2種怎樣做TALEN怎樣做TALENTALEN技術(shù)成功率影響因素重組TALEN模塊與靶位點(diǎn)的‘親合力’靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)原則來自20個(gè)天然TLAE的統(tǒng)計(jì)規(guī)律細(xì)胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困難細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率不同，293高，HeLa低所期待的目標(biāo)Heterozygous？Homozygous？Exactpointmutation？Selectionmarkerinsertion？TALE技術(shù)應(yīng)用范圍細(xì)菌：尚無報(bào)道，已另有多種高效靶向技術(shù)。真菌：有報(bào)道，TALE原理可行。植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞：TALE原理可行，各細(xì)胞系效率不一。斑馬魚：有TALEN基因敲除報(bào)道，尚無點(diǎn)突變與敲入報(bào)道。小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚無報(bào)道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建實(shí)驗(yàn)周期較長）。TALEN應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵：切實(shí)可靠的表達(dá)系統(tǒng)。高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。TALEN的植物應(yīng)用TingLiet.al.High-efficiencyTALEN-basedgeneeditingproducesdiseaseresistantrice，

volume30number5may2012NatureBiotechnology

背景水稻病原菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)導(dǎo)致細(xì)菌性白葉枯病。細(xì)菌天然TALEAvrXa7orPthXo3與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控（hijack）此基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖份向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，便于病原菌利用。策略以TALEN對(duì)細(xì)菌TALE靶點(diǎn)區(qū)做突變，使細(xì)菌TALE無法與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合。

結(jié)果突變水稻獲得抵御細(xì)菌感染的能力TALEN與主要類同技術(shù)比較siRNA優(yōu)于TALEN可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速觀察效果Knockdown效果確實(shí)，可用于必須基因遜于TALEN瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果短暫不是徹底knockout慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機(jī)整合ZFN優(yōu)于TALEN經(jīng)驗(yàn)積累多，技術(shù)較成熟遜于TALEN技術(shù)復(fù)雜，難度高，被Sigma公司壟斷靶點(diǎn)序列要求高，難找Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性基因組精密工程

今年來自梅奧醫(yī)學(xué)中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它們，對(duì)斑馬魚基因組部分序列進(jìn)行了定制修改。這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）方法，相比ZFNs和morpholinos，TALENs具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：它們更便宜、更有效，尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時(shí)。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對(duì)任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效應(yīng)是短暫的，而TALENs可造成永久性的改變。隨后科學(xué)家們?cè)隗蛤艿绕渌鼊?dòng)物中展開了這方面的研究，證明這種技術(shù)與已證實(shí)的基因靶向技術(shù)一樣有效。國內(nèi)清華大學(xué)的施一公和顏寧等人也于今年在Science雜志上報(bào)道了TALE特異識(shí)別DNA的分子機(jī)理，這提供了TALE蛋白的改造基礎(chǔ)，極大地拓寬了TALE蛋白在生物技術(shù)應(yīng)用上的前景。新技術(shù)介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù)Biotechnology:RewritingagenomeNature

495,

50–51

(07March2013)

doi:10.1038/495050a1CRISPR-Cas概述1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。2013以后，研究者們?cè)诎ā秙cience》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。1CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。CRISPR-Cas主要由兩部分組成：識(shí)別切割1CRISPR-Cas概述1.1CRISPR結(jié)構(gòu)CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）

CRISPR是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)