微生物菌肥菌種的篩選

微生物菌肥菌種的篩選

近年來，由于化肥的長(zhǎng)期使用，土壤硬化、土壤肥力下降、環(huán)境破壞、污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降。微生物菌肥的開發(fā)、推廣應(yīng)用受到了農(nóng)業(yè)科技界的高度重視。微生物菌肥作為一種新的農(nóng)業(yè)技術(shù)措施,在發(fā)展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)中的作用正逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)的微生物肥料已經(jīng)在大面積推廣應(yīng)用中,新型的微生物菌肥品種不斷開發(fā)出來。微生物肥是由具有特殊效能的微生物經(jīng)過發(fā)酵而制成的、含有大量有益微生物、對(duì)作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料利用微生物的生命活動(dòng),將作物不能吸收利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可被作物吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物,改善作物的營(yíng)養(yǎng)條件,有些兼有刺激作物生長(zhǎng)或增強(qiáng)抗病性的作用,以提高作物產(chǎn)量,改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。它既能增加農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯,又具有工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物有效利用、防止環(huán)境污染、改進(jìn)土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力和保護(hù)生態(tài)良性循環(huán)的巨大社會(huì)效益和生態(tài)效益。它的問世,符合發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)和開發(fā)無公害食品的新趨勢(shì),對(duì)我國(guó)乃至世界肥料工業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義,具有十分廣闊的應(yīng)用前景。1材料和方法1.1培養(yǎng)基的制備菌種:從美國(guó)進(jìn)口的奧卡尼克微生物菌肥菌種。培養(yǎng)基:牛肉膏培養(yǎng)基、阿須貝培養(yǎng)基、解磷菌培養(yǎng)基、解鉀菌培養(yǎng)基,均加蒸餾水1000ml,瓊脂18g。于121℃滅菌30min,備用。1.2測(cè)試方法1.2.1培養(yǎng)基的制備稱取1g菌種,溶于100ml無菌水中,制成菌懸液使其稀釋度為10-2,在無菌操作的條件下,采用混菌平板法,制作培養(yǎng)皿10個(gè),每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1ml菌懸液,分別倒入以上5種培養(yǎng)基,每個(gè)培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù),混勻冷卻,置25℃條件下培養(yǎng),5d后觀察結(jié)果。1.2.2蘑菇的純度5d后各種培養(yǎng)基上長(zhǎng)出細(xì)菌的菌落,在無菌操作的條件下對(duì)其進(jìn)行純化培養(yǎng),純化方法可采用平板劃線法。1.2.3加強(qiáng)整理后的細(xì)菌形態(tài)觀察通過對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和肉眼觀察,鑒定其革蘭氏反應(yīng)和菌落的特征及性質(zhì)。進(jìn)行革蘭氏染色,要選用適齡菌種,以培養(yǎng)18~24h為宜,涂片時(shí)要菌量適中,涂布應(yīng)薄而均勻,同時(shí)應(yīng)掌握好脫色時(shí)間,不可過長(zhǎng),不可過短。至于菌落特征,在本實(shí)驗(yàn)中,主要觀察細(xì)菌在平板上的特征。菌落特征主要包括菌落的大小,形狀(圓形、假根狀、不規(guī)則狀等),隆起情況(如擴(kuò)展、臺(tái)狀、低凹、凸面、乳頭狀等),邊緣(如邊緣整齊、波狀、裂葉狀、鋸齒狀等),表面光澤(如閃光、不閃光、金屬光澤等),表面狀態(tài)(如光滑、皺褶、顆粒狀等),透明度(如不透明、半透明等)。1.2.4稀釋液的稀釋稱取1g菌肥,放入裝有100ml無菌水的250亳升三角瓶中,用手或振蕩機(jī)振蕩20分鐘,使微生物細(xì)胞充分分散,靜置20~30分鐘,即得10-2稀釋液,再用1ml無菌吸管吸取10-2稀釋液1ml移入裝有9ml無菌水的試管中,充分振蕩搖勻(或吹吸3次使之混勻),即得10-3稀釋液;再換一支無菌吸管,吸取10-3稀釋液1ml移入另一個(gè)裝有9ml無菌水的試管中,即得10-4稀釋液;依次類推,每次更換吸管連續(xù)稀釋,則可制成10-5、10-6、10-7、10-8等一系列樣品稀釋液,供平板接種使用。依次采用稀釋度(如10-3)后,取無菌培養(yǎng)皿3個(gè),注明10-3的稀釋液。然后按無菌操作的要求,用1ml無菌吸管吸取10-3稀釋液各1ml分別放入標(biāo)記為10-3的3個(gè)培養(yǎng)皿中,其他稀釋度依次類推。然后按無菌操作手續(xù)在各培養(yǎng)皿中分別倒入已熔化并冷卻至45~50℃的選擇性培養(yǎng)基(固氮菌阿須貝培養(yǎng)基、解磷菌培養(yǎng)基、解鉀菌培養(yǎng)基)約15ml,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,使稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻,待凝固后將培養(yǎng)皿倒置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至長(zhǎng)出菌落后即可記數(shù),大約需4~6d。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基上菌落的分類分離5d后觀察結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)在牛肉膏培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)有多種多樣,按菌落特征劃分主要有3大類,而固氮菌阿須貝培養(yǎng)基、解鉀菌培養(yǎng)基、解磷菌培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落在同一培養(yǎng)基的特征是相同的。因?yàn)楹笕哂眠x擇性培養(yǎng)基,這就說明微生物菌肥中的菌株主要有3種:固氮菌、解磷菌、解鉀菌。2.23稀釋度大小的標(biāo)準(zhǔn)以平板上出現(xiàn)的30~300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度平板為標(biāo)準(zhǔn),有2個(gè)稀釋度平均菌落數(shù)在30~300之間,若其比例小于2,則以兩者的平均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),若比例大于2,則以稀釋度小的為標(biāo)準(zhǔn)。若3個(gè)稀釋度平均菌落數(shù)大于300,按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù),平均菌落數(shù)小于30,按稀釋度最低者平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。若均不在30~300之間,則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。按以上規(guī)則,求得固氮菌、解鉀菌、解磷菌的菌落數(shù)分別為3.07×106、2.9×105、9.6×104,所以,其比例為32∶3∶1(表1)。2.3菌落形狀的測(cè)定菌落特征觀察試驗(yàn)表明(表2):4種菌菌落均為濕潤(rùn),固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌菌落的形狀固定為圓形,而有機(jī)磷細(xì)菌、解鉀菌菌落的形狀則多種多樣,沒有統(tǒng)一形狀,在顏色方面,除解鉀菌為黃色外,其余3種菌均為白色。4種菌菌落的邊緣、隆起狀況各異,表面則大多光滑,只有有機(jī)磷細(xì)菌菌落的表面為顆粒狀。2.4革蘭氏染色通過實(shí)驗(yàn)菌的檢測(cè),可將氏陰性菌的鑒定為革蘭氏染色的結(jié)果說明(表3):4種菌均為革蘭氏陰性菌,細(xì)胞形狀有球形、扁球形、棒狀,無機(jī)磷細(xì)菌和解鉀菌有芽孢,有機(jī)磷細(xì)菌和固氮菌無芽孢,芽孢在革蘭氏染色過程中不被染色。3菌肥菌種與國(guó)外的對(duì)比由上述試驗(yàn)可知,微生物菌肥中的菌株主要有3種:固氮菌、解磷菌、解鉀菌,它們的比例是32∶3∶1。