葡聚糖水凝膠微球的制備與表征

葡聚糖水凝膠微球的制備與表征張穩(wěn);陶森林;蘇紅瑩;賈慶明;陜紹云【摘要】采用反相微乳液交聯(lián)法,以葡聚糖天然高分子為原料,制備了一系列基于葡聚糖的水凝膠微球.葡聚糖通過高碘酸鈉氧化進行醛基化修飾,進一步與乙二胺發(fā)生還原胺化反應(yīng)進行交聯(lián);交聯(lián)反應(yīng)在以失水山梨酸酯類(Span80/Tween80)表面活性劑復配體系作為乳化劑、環(huán)己烷為油相構(gòu)成的油包水型反相微乳液中進行.表面活性劑復配體系的組分配比是影響該葡聚糖水凝膠微球的粒徑及形貌的重要因素,研究結(jié)果表明，隨著表面活性劑復配體系的親水親油平衡值(HLBvalue)增加,微球粒徑呈現(xiàn)先減小而后增大并基本保持不變的趨勢;當該復配表面活性劑的HLB=5.27(即,m(Tween80)/m(Span80)=10)時，獲得的葡聚糖凝膠微球粒徑最小且平均粒徑為(21.6±1.65)pm,粒徑分布在15~28pm之間.％Microgelsbasedondextranwerepreparedbytheinversemicroemulsioncross-linkingtechniqueusingSpan80/Tween80asmixed-surfactantsandcyclohexaneasthecontinuousphase.Thesehydrogelparticleswereformedinthewater-in-oil(W/O)microemulsionsystemviathereductiveaminationreactionbetweentheoxidizeddextran(Dex-CHO)andethylenediamineatroomtemperature.Effectofthecompositionofthemixedemulsifier(orHLBvalue)onthesizeofthemicrogelswasstudied.SEMandDLSmeasurementshowedthattheparticlesizeoftheresultedmicrogelwascontrollablebymodulatingthecompositionofthemixed-surfactants(HLBvalue).WhenHLBvalueincreased,theparticlesizeoftheresultedmicrogeldecreasedfirstly,thenincreased,andmaintainconstantlyatlast.Dextran-basedmicrogelssynthesizedusingthemixed-surfactantofSpan80/Tween80wereobviouslysmallerthanthatpreparedwithSpan80.And,dextranmicrogelwitharelativelysmalldiameterof(21.60±1.65)pmandparticlesizedistributionbetween15and28pmwaspreparedastheHLB=5.27(m(Tween80)/m(Span80)=10).【期刊名稱】《功能材料》年(卷),期】2017(048)002【總頁數(shù)】6頁(P2231-2235,2240)【關(guān)鍵詞】葡聚糖;水凝膠微球;反相微乳液;還原胺化反應(yīng)【作者】張穩(wěn);陶森林;蘇紅瑩;賈慶明;陜紹云【作者單位】昆明理工大學化學工程學院,昆明650500;昆明理工大學化學工程學院,昆明650500;昆明理工大學化學工程學院,昆明650500;昆明理工大學化學工程學院,昆明650500;昆明理工大學化學工程學院,昆明650500【正文語種】中文【中圖分類】O636.1;Q5水凝膠微球結(jié)合了水凝膠的軟濕性能和微球顆粒的特性，且它的刺激響應(yīng)性類似于開放的生物系統(tǒng)，生物體中的許多軟組織具有類似水凝膠微球的結(jié)構(gòu)，因而在生物醫(yī)藥、化學分離等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值［1-2］。20世紀60年代,Wichterle和Lim首次合成了交聯(lián)的HEMA水凝膠［3］，它的親水特性和潛在的生物相容性引起了生物材料科學家的較大興趣。聚合物成為高分子水凝膠材料必須具備兩個條件：高分子主鏈或側(cè)鏈上帶有大量的親水基團和具有適當?shù)慕宦?lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。制備高分子水凝膠材料的起始原料可以是單體(水溶性或油溶性單體)、聚合物(天然或合成聚合物)、或者是單體和聚合物的混合體［4］。目前常用的天然高分子材料中，葡聚糖(dextran)是一種可降解細菌多糖，來源豐富，作為一種生物材料應(yīng)用具有良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于藥物輔料和生物分離，其長鏈上的羥基極易進行修飾得到具有反應(yīng)活性的葡聚糖衍生物，可通過不同方式進行交聯(lián)形成水凝膠網(wǎng)絡(luò)［5-7］。葡聚糖水凝膠微球作為一類藥物載體材料，具有良好的生物相容性，并可提高藥物穩(wěn)定性，對藥物有緩釋作用［8-10］。此類納米材料的新家族目前已被提出作為蛋白質(zhì)、疫苗等環(huán)境敏感型分子的保護載體［11-12］；可作為生物大分子和顯像劑使用［13］；在不久的將來還可被用作傷口輔料［14］等。水凝膠微球的小尺度是其性質(zhì)和功能的基礎(chǔ)，因此獲得尺度均一可控的水凝膠微球是其制備方法的技術(shù)關(guān)鍵。凝膠微球的制備方法很多，例如原位聚合法［15］、原位紫外聚合法［16］、回流沉淀聚合法［17］等，以上方法雖然能制備出凝膠微球，但存在制備過程復雜或反應(yīng)條件苛刻以及聚合產(chǎn)物的顆粒中會包藏有少量單體等問題［18］。反相微乳液交聯(lián)法是以油包水(W/0)型反相微乳液作為微反應(yīng)器，通過交聯(lián)劑對修飾了活性反應(yīng)基團的水溶性聚合物進行交聯(lián)，獲得穩(wěn)定的凝膠狀納米網(wǎng)絡(luò)［19-21］，該法具有通過改變微乳液結(jié)構(gòu)參數(shù)、調(diào)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)來控制水凝膠微球的粒徑、形貌的特點，并且反應(yīng)條件簡單，因此是目前較為新穎的一種制備水凝膠微球的方法［22］。本文采用葡聚糖為原料、乙二胺為交聯(lián)劑，通過反相微乳液交聯(lián)法制備了基于葡聚糖的水凝膠微球(如圖1所示)。微乳液體系以失水山梨酸酯類(Span80/Tween80)復配表面活性劑作為乳化劑，醛基化葡聚糖水溶液為水相，環(huán)己烷為油相。通過對表面活性劑復配體系(Span80/Tween80)親水親油平衡值(HLBvalue)進行調(diào)控(4.30~6.08)來控制水凝膠微球的粒徑大小。該葡聚糖凝膠微球有望作為載體材料應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域。原料與試劑葡聚糖，dextran，分子量MW=40000Da,Aladdin化學公司；高碘酸鈉，NaI04，99.0%，Aladdin化學公司；Span80，AR，SIGMA；Tween80，AR，SIGMA-ALORCH;硼氫化鈉，NaBH4，98.0%，Aladdin化學公司；乙二胺，C2H4(NH2)2,AR,>99.0%,天津市風船化學試劑科技有限公司；環(huán)己烷，C6H12,AR，天津市風船化學試劑科技有限公司；乙醇，C2H5OH,AR，天津市風船化學試劑科技有限公司；丙三醇，HOCH2CHOHCH2OH,AR，成都市科龍化工試劑廠；實驗用水為去離子水，由昆明理工大學提供。透析袋(MWCO=7000Da)，購自上海綠鳥科技發(fā)展有限公司，使用前需用去離子水浸泡。氧化葡聚糖的制備以葡聚糖天然高分子作為基礎(chǔ)材料，通過高碘酸鈉對其進行部分氧化，獲得醛基化葡聚糖，具體操作如下：精密稱取適量葡聚糖置于圓底燒瓶中，加入去離子水中攪拌至完全溶解，加入等摩爾(相對于葡聚糖分子上的葡萄糖單位)的高碘酸鈉(NaIO4)，在室溫、避光條件下攪拌反應(yīng)4h，加入適量丙三醇終止反應(yīng)；所得溶液置于截留分子量為7000Da的再生纖維素透析袋中，以去離子水為介質(zhì)透析2d，透析過程中每3h換一次去離子水，透析液通過冷凍干燥得到醛基化葡聚糖白色固體。氧化葡聚糖氧化程度的滴定取氧化葡聚糖適量，精密稱定，于25mL,0.25mol/L的鹽酸羥胺水溶液中(含甲基橙0.05%)，室溫下放置3h，以標準氫氧化鈉溶液(0.098mol/L)滴定至紅色變黃色，并作空白對照。醛基含量即每克氧化葡聚糖含有的醛基摩爾數(shù)用下式計算醛基的氧化度即100個葡萄糖單位含醛基的個數(shù)用下式計算式中，V1為樣品液消耗NaOH的體積,mL；V0為空白液消耗NaOH的體積，mL；M為氫氧化鈉的摩爾濃度；Mw為氧化葡聚糖鏈上重復單元的摩爾質(zhì)量，160g/mol;W為氧化葡聚糖的質(zhì)量，g。葡聚糖水凝膠微球的制備根據(jù)反相微乳液交聯(lián)法的原理，采用表面活性劑復配體系作為乳化劑來制備葡聚糖水凝膠微球。具體操作如下：稱取醛基化葡聚糖溶于去離子水中，得到濃度為75mg/mL的溶液備用；取6mL環(huán)己烷滴入含有復配表面活性劑Span80/Tween80(分別取m(Tween80)/m(Span80)不同質(zhì)量比的小玻璃瓶中，攪拌3min，使其充分溶解；然后將制備好的醛基化葡聚糖水溶液1mL緩慢滴入小玻璃瓶中，劇烈攪拌15min，充分乳化；再向獲得的反相微乳液中滴入8.5pL乙二胺溶液，室溫、攪拌條件下反應(yīng)20h，所得溶液通過離心(5000r/min,3min)收集沉淀，沉淀物用乙醇反復洗5~6次，去除乳化劑，得到葡聚糖水凝膠微球，并分散于去離子水中保存。葡聚糖水凝膠微球的還原將葡聚糖水凝膠微球分散于去離子水中，加入適量(硼氫化鈉與N—鍵的摩爾比取5:1)硼氫化鈉(NaBH4)，室溫下攪拌反應(yīng)24h，然后把所得溶液通過離心收集沉淀，沉淀物用去離子水反復洗3~4次，得到還原后的葡聚糖水凝膠微球，并分散于去離子水中保存。測試與表征紅外光譜測試采用德國Bruker公司的VERTEX70型傅立葉變換紅外光譜儀，以KBr壓片和傅立葉變換衰減全反射(ATR)法進行測試。掃描電子顯微鏡采用TESCAN公司的VEGA3SBH型號來表征水凝膠微球的形貌，測試前把稀釋過的水凝膠微球滴在單晶硅上，室溫干燥后，對樣品進行噴金處理。采用上海美譜達儀器有限公司的紫外可見光分光光度計UV-1800PC型來測試水凝膠微球還原前后的結(jié)構(gòu)變化。采用動態(tài)激光光散射儀(DLS，英國Mastersizer2000)對葡聚糖水凝膠微球的粒徑進行測定。氧化葡聚糖的紅外光譜分析采用高碘酸鈉氧化葡聚糖的方法獲得醛基化葡聚糖，并通過鹽酸羥胺滴定法對其氧化程度進行了測定，結(jié)果表明，獲得的氧化葡聚糖醛基含量為(6.37±0.015)mmol/g，氧化度為(117.60±0.08)%,證明了葡聚糖上的羥基部分被氧化為醛基。采用紅外光譜儀對合成的氧化葡聚糖結(jié)構(gòu)進行了測定，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，相對于葡聚糖(圖2(a))，氧化葡聚糖(圖2(b))在1729.86cm-1處出現(xiàn)了醛基上羰基O)的伸縮振動吸收峰，表明葡聚糖分子鏈上的羥基被高碘酸鈉氧化成了醛基；另外，從圖譜中還可以看出，氧化葡聚糖除出現(xiàn)了的伸縮振動吸收峰外，其它的紅外吸收峰基本上與葡聚糖的一致，也進一步說明葡聚糖上的羥基只是部分被氧化，氧化葡聚糖具有與類似葡聚糖的骨架結(jié)構(gòu)。葡聚糖水凝膠微球的紅外與紫外光譜分析本文采用反相微乳液交聯(lián)法，通過氧化葡聚糖和乙二胺之間發(fā)生還原胺化反應(yīng)制備葡聚糖水凝膠微球，并通過紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，相比于氧化葡聚糖(圖3(a))，交聯(lián)后的氧化葡聚糖(圖3(b))中波長為1729.86cm-1的吸收峰消失了，此吸收峰為醛基上羰基O)的伸縮振動吸收峰，說明氧化葡聚糖上的醛基與乙二胺發(fā)生反應(yīng)消耗了；圖3(a)、(b)在3440.60和2932.33cm-1處都出現(xiàn)2個強而寬的吸收峰，分別歸屬于糖類羥基(一OH)的伸縮振動吸收峰和亞甲基(一CH2—)的反對稱伸縮振動吸收峰，除在1729.86和1637.31cm-1處不同外，其它各主要吸收峰基本一致，在1045.99cm-1處為葡聚糖糖苷鍵(—C—O—C—)的伸縮振動吸收峰，說明葡聚糖水凝膠微球中也存在葡聚糖的骨架結(jié)構(gòu)。由于席夫堿結(jié)構(gòu)在酸性條件下穩(wěn)定性較差，為了獲得具有良好穩(wěn)定性的水凝膠微球，本文采用硼氫化鈉對獲得的葡聚糖水凝膠微球進行了還原，還原后的葡聚糖凝膠微球紅外光譜如圖3(c)所示。還原前，葡聚糖水凝膠微球(圖3(b))結(jié)構(gòu)中的N—基團的伸縮振動吸收峰在1680-1640cm-1范圍出峰，被葡聚糖表面吸附的水分子中的羥基（一OH）彎曲震動吸收峰所覆蓋；還原后，葡聚糖水凝膠微球（圖3（c））結(jié)構(gòu)中的一C—N—的伸縮振動吸收峰在1140-1110cm-1范圍出峰，被葡聚糖糖苷鍵（一C—O—C—）的伸縮振動吸收峰所覆蓋。本文采用紫外-可見光分光光度計對還原前后的葡聚糖凝膠微球進行了進一步表征，結(jié)果如圖4所示。據(jù)文獻報道[21],席夫堿結(jié)構(gòu)常在280-325nm波長范圍內(nèi)有紫外吸收。從圖4可以看出，還原前，葡聚糖水凝膠微球（圖4（a））在280-330nm波長范圍出現(xiàn)了席夫堿結(jié)構(gòu)的紫外吸收峰；還原后的葡聚糖水凝膠微球（圖4（b））在該波長范圍內(nèi)的吸收峰消失。結(jié)合反應(yīng)過程中溶液顏色由橙紅色褪為米白色的現(xiàn)象，以及席夫堿結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差的性質(zhì)，可以判斷，葡聚糖水凝膠微球中的席夫堿結(jié)構(gòu)N—）被還原為一C—N—結(jié)構(gòu)，導致其在紫外吸收光譜中的吸收峰消失。葡聚糖水凝膠微球的形貌與粒度分析反相微乳液交聯(lián)法是目前常用的水凝膠微球制備方法，而選擇適當?shù)谋砻婊钚詣╊愋褪怯绊懺摲椒ǐ@得的水凝膠微球的形貌和粒徑的關(guān)鍵因素之一。通常，每種乳化劑都對應(yīng)有其特定的HLB值，在制備微乳液體系的過程中，單一乳化劑往往難以滿足復雜微乳液體系的乳化要求，因此，常將兩種及兩種以上具有不同HLB值的乳化劑混合使用，即構(gòu)成表面活性劑復配體系，實現(xiàn)改善乳化效果、調(diào)控微乳液液滴粒徑等目的。HLB值不同，所形成的膠束濃度也不同。當HLB值在一定范圍內(nèi)時，乳化劑用量越多，體系中膠束濃度越高，形成的膠束多而且平均粒徑小，粒徑分布寬，有利于反相微乳液的穩(wěn)定。但乳化劑用量過多，導致體系粘度增大，難以攪拌，反應(yīng)熱難以散失，容易出現(xiàn)凝絮，界面能增大，耐電解質(zhì)能力下降，并出現(xiàn)大量難以消除的泡沫，對反相微乳液交聯(lián)以及整個乳液體系造成不良影響。若乳化劑用量少，體系中乳化劑膠束濃度就低，界面積比較大的情況下，界面上的乳化劑分子少，不能形成穩(wěn)定的界面膜，乳狀液很容易破乳，成核期變長，轉(zhuǎn)化率降低，粒徑變大，粒徑分布也同時變寬。通常乳化劑較多時，乳狀液越穩(wěn)定，但是過多的乳化劑使成本增加，而微乳液的穩(wěn)定性并不隨乳化劑的加入量線性增加，因此往往有一個合適的乳化劑加入量［23-25］。制備油包水(W/0)型反相微乳液的乳化劑HLB值常在3~6之間，因此，本文采用非離子型表面活性劑Span80/Tween80復配體系作為乳化劑制備葡聚糖凝膠微球，并與單一Span80作為乳化劑進行了對比。實驗中采用的Span80/Tween80復配體系的HLB值以及獲得的凝膠微球的粒徑大小如表1所示。從表1可以看出，使用單一Span80作為乳化劑獲得的葡聚糖凝膠微球粒徑較大(62.83pm),而使用Span80/Tween80復配體系制備的凝膠微球粒徑相對較?。磺译S著表面活性劑復配體系HLB值在可調(diào)范圍內(nèi)增加，獲得的葡聚糖凝膠微球的粒徑呈現(xiàn)先減小后增大并基本保持不變的趨勢，當該表面活性劑復配體系的HLB=5.27時，獲得的凝膠微球具有最小的粒徑(21.60pm)。注：a為MeansizeofthedextranmicrogelsweremeasuredbyDLSinwater本文進一步采用SEM對不同表面活性劑復配條件下制備的葡聚糖水凝膠微球的形貌進行了表征，結(jié)果如圖5所示。從圖5(a沖可以看出，以單一Span80為乳化劑制備的葡聚糖凝膠微球為較大的圓球形顆粒，微球表面光滑，粒徑分布較寬；而以Span80/Tween80復配體系(HLB=5.27)為乳化劑制備的凝膠微球具有更小的粒徑，且粒徑分布更為均勻，平均粒徑分布在20pm左右，相對于單一表面活性劑所制備的微球，尺寸明顯減小。實驗中獲得的葡聚糖凝膠微球在水溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性，圖6為Span80/Tween80復配體系(HLB=5.27)條件下獲得的凝膠微球分散于水中的粒徑分布(DLS)圖。從圖5可知，微球平均粒徑為(21.60±1.65)pm,粒徑分布在15~28pm之間，這與SEM表征結(jié)果一致。通過反相微乳液交聯(lián)法，以天然高分子葡聚糖為材料基礎(chǔ)，乙二胺為交聯(lián)劑，在室溫條件下通過醛基和氨基的還原胺化反應(yīng)，制備了一系列粒徑分布在10-70pm的水凝膠微球。通過對表面活性劑(Span80/Tween80)復配比例的調(diào)節(jié)，對獲得的葡聚糖水凝膠微球的粒徑大小進行調(diào)控，當乳化劑復配體系的HLB=5.27時，所得微球的球形度較好、表面光滑、粒徑較小，其平均粒徑為(21.60±1.65)pm，且粒徑分布在15-28pm之間。獲得的葡聚糖凝膠微球具有制備過程溫和簡單，粒徑可控等優(yōu)點，可作為載體材料應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化學分離等領(lǐng)域?！鞠嚓P(guān)文獻】DitizioV,KarlgardC,LilgeL,etal.Localizeddrugdeliveryusingcrosslinkedgelatingelscontainingliposomes:factorsinfluencingliposomestabilityanddrugrelease[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearch,2000,51(1):96-106.KuijpersAJ,EngbersGH,KrijgsveldJ,etal.Cross-linkingandcharacterisationofgelatinmatricesforbiomedicalapplications[J].JournalofBiomaterialsSciencePolymerEdition,2000,11(3):225-43.WichterleO,LiMD.Hydrophilicgelsforbiologicaluse[J].Nature,1960,185(4706):117-118.ZouXinxi.Super-absorbentAgent[M].Beijing:ChemicalIndustryPress,2001.鄒新禧?超強吸水劑[M].北京:化學工業(yè)出版社,2001.LiuY,Chan-ParkMB.Abiomimetichydrogelbasedonmethacrylateddextran-graft-lysineandgelatinfor3Dsmoothmusclecellculture[J].Biomaterials,2010,31(6):1158-70.SunG,ShenYI,KusumaS,etal.Functionalneovascularizationofbiodegradabledextranhydrogelswithmultipleangiogenicgrowthfactors[J].Biomaterials,2011,32(1):95-106.NguyenK,DangPN,AlsbergE.Functionalized,biodegradablehydrogelsforcontroloversustainedandlocalizedsiRNAdeliverytoincorporatedandsurroundingcells[J].ActaBiomaterialia,2013,9(1):4487-4495.BasakP,AdhikariB.Poly(vinylalcohol)hydrogelsforpHdependentcolontargeteddrugdelivery[J].JournalofMaterialsScienceMaterialsinMedicine,2009,20(1):137-146.YuF,CaoX,LeiZ,etal.AninterpenetratingHA/G/CSbiomimichydrogelviadiels-alderclickchemistryforcartilagetissueengineering[J].CarbohydratePolymers,2013,97(1):188-195.HanXue,CaoJiangyongquan,ZhouJiangling,etal.ApHresponsivedual-drugdeliverysystembasedonchitosan[J].ActaPolymericaSinica,2015(12):1471-1476.韓雪，曹蔣永荃,周江玲，等?基于殼聚糖的pH響應(yīng)雙重藥物釋放系統(tǒng)研究J].高分子學報，2015(12):1471-1476.SchoubbenA,BlasiP,GiovagnoliS,etal.Novelcompositemicroparticlesforproteinstabilizationanddelivery[J].EuropeanJournalofPharmaceuticalSciencesOfficialJournaloftheEuropeanFederationforPharmaceuticalSciences,2009,36(2-3):226-234.YuCY,YinBC,ZhangW,etal.Compositemicroparticledrugdeliverysystemsbasedonchitosan,alginateandpectinwithimprovedpH-sensitivedrugreleaseproperty[J].Colloids&SurfacesBBiointerfaces,2008,68(2):245-249.XiJ,ZhouL,DaiH.Drug-loadedchondroitinsulfate-basednanogels:preparationandcharacterizati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