基于生物信息學(xué)分析的忍冬及其變種es-ssr鑒定

基于生物信息學(xué)分析的忍冬及其變種es-ssr鑒定

金銀花是臨床上常用的中藥。具有清熱解毒、祛風(fēng)解熱的功效。它是傳統(tǒng)方劑銀擠散、中藥雙黃連注射液和熱毒寧注射液的主要成分。作為《中國藥典》的收載品種,金銀花已被現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、保肝、中樞興奮和神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血等作用。金銀花源自忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初開的花。在2005版藥典中,已明確將忍冬的近緣種紅腺忍冬(L.hypoglaucaMiq.)、華南忍冬(L.confusa(Sweet)DC.)、灰氈毛忍冬(L.macranthoidesHand.-Mazz.)和黃褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng)列為山銀花。而在此之前,金銀花和山銀花同歸于金銀花使用,且西南地區(qū)民間也一直有把南江忍冬、孤腺忍冬等忍冬科植物作為金銀花入藥的習(xí)慣,因此金銀花誤用現(xiàn)象一直較為嚴(yán)重。為了確保金銀花原植物的正確,人們嘗試了通過原植物形態(tài)及飲片特征、化學(xué)成分、顯微特征及許多分子標(biāo)記如RAPD、RFLP、DNAbarcoding、位點(diǎn)特異性PCR來鑒定金銀花及其偽品。然而,近年來隨著金銀花的需求量不斷增大、價(jià)格不斷上漲,引種面積和新產(chǎn)地的不斷增加,也出現(xiàn)了許多新的農(nóng)家品種和種系,導(dǎo)致金銀花商品藥材使用十分混亂。一方面由于金銀花種及變種間的形態(tài)學(xué)及化學(xué)成分具有高度的相似性,使用傳統(tǒng)手段鑒別十分困難;另一方面,金銀花引種栽培面積極廣,各產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境差異很大,不同產(chǎn)地的金銀花形態(tài)和化學(xué)成分之間變異很大,造成使用形態(tài)學(xué)、化學(xué)甚至藥理的手段對金銀花類藥材種下水平進(jìn)行鑒別所得結(jié)論常存在爭議。因此,急需建立科學(xué)性強(qiáng)、使用方便的新種質(zhì)鑒別方法。SSR(simplesequencerepeat)又稱微衛(wèi)星,一般指1到6個(gè)核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列或2到8個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)。與其他分子標(biāo)記相比,SSR具有分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)位點(diǎn)多、信息含量豐富、物種間轉(zhuǎn)移性好、易于檢測和重復(fù)性好的特點(diǎn),在多種藥材和作物中已用于遺傳學(xué)的研究。作者已對忍冬及其變種紅白忍冬花蕾材料進(jìn)行了RNA-seq測序,經(jīng)過去除冗余和拼接,共獲得116340條忍冬和107602條紅白忍冬EST序列。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)分析手段篩選用于鑒別忍冬及其變種的EST-SSR標(biāo)記,并采集48份金銀花類藥材的原植物和4份藥材進(jìn)行驗(yàn)證,建立了基于EST-SSR的金銀花及其變種的分子鑒別方法,為中藥材原植物種下水平鑒別提供了新的思路。實(shí)驗(yàn)材料及pcr擴(kuò)增檢測鑒別EST-SSR的篩選通過以忍冬EST序列作為數(shù)據(jù)庫,使用blastN(/Blast.cgi)尋找忍冬對紅白忍冬的同源序列;以紅白忍冬EST序列作為數(shù)據(jù)庫,使用blastN尋找紅白忍冬對忍冬的同源序列;識別標(biāo)準(zhǔn)均為e值≤1e-30m值為60℃;GC含量為40%~60%,最適50%。從中隨機(jī)選擇15對引物,由北京六合華大基因有限公司合成,如表1所示。植物材料選取48份金銀花類藥材原植物,包括14個(gè)原種、12個(gè)變種、22個(gè)山銀花;4份購自市場上經(jīng)過炮制處理的藥材;共52份樣品。樣品主要采自廣西、河南、山東、江蘇地區(qū),憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。實(shí)驗(yàn)材料詳見表2?？侱NA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測取500mg硅膠干燥材料,參考CTAB法提取總DNA,調(diào)整終質(zhì)量濃度大約為100ng·μL-1。PCR反應(yīng)體系(25μL):2.5μL10×PCRbuffer,2μL2.5mmol·L-1dNTPs,10μmol·L-1引物各1μL,2.5UrTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司),1μLDNA模板。反應(yīng)在ABI公司的9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性10min;94℃變性30s,54~55℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染檢測。基于EST-SSR的遺傳多樣性使用遺傳分析軟件POPGENE32分析等位基因頻率,選擇標(biāo)記類型為二倍體共顯性標(biāo)記。用PIC_CALC軟件(/u/695591/PIC_CALC.rar)分析多態(tài)性含量(PIC),PIC計(jì)算式為。其中,Pi表示第i個(gè)等位基因出現(xiàn)的頻率,k是此標(biāo)記的所有等位基因的總數(shù)。使用SPSS17.0對分析結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析,方法為配對t檢驗(yàn)。結(jié)果與討論1忍冬est序列中ssr的分布在本實(shí)驗(yàn)室的藥用植物基因數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)獲得了116340條忍冬EST序列和107602條紅白忍冬EST序列,拼接長度分別為16117.9kb和21116.4kb。通過SSR程序的查找,在忍冬的EST序列中共獲得3984條SSR,分布于3705條EST序列中,包含SSR的EST序列頻率為3.18%,平均每4.05kb出現(xiàn)一個(gè)SSR;在變種紅白忍冬中共獲得2818條SSR,分布于2634條EST序列中,含SSR的EST序列頻率為2.45%,SSR在EST序列上的分布約為7.49kb每個(gè)SSR。從表3分析數(shù)據(jù)可以看出,忍冬EST序列中SSR含量非常豐富,在識別標(biāo)準(zhǔn)為二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基序、最小重復(fù)次數(shù)分別為9、6、5、4、4次的條件下,忍冬的SSR頻率依然遠(yuǎn)高于擬南芥(13.8kb)、玉米(8.1kb)、棉花(20.0kb)等。目前尚未有關(guān)變種與原種之間EST-SSR含量比較的報(bào)道。在本研究中,忍冬SSR頻率高于紅白忍冬,且序列平均間隔低于紅白忍冬,形成這一現(xiàn)象的原因可能有以下幾個(gè)方面:(1)SSR在cDNA上分布不均勻,即由于RNA的含量差異及測序覆蓋范圍的不同,造成SSR含量的差異。(2)SSR識別條件的限制,即由于使用較為嚴(yán)格的識別條件,紅白忍冬SSR的重復(fù)次數(shù)均偏低而形成差異。當(dāng)把識別條件修改為二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基序、最小重復(fù)次數(shù)分別為6、5、4、4、4次時(shí),忍冬SSR總數(shù)為4510條,紅白忍冬為4706條,分別為每3.58kb和4.49kb出現(xiàn)一個(gè)SSR,則與預(yù)期相符。(3)忍冬為栽培藥用植物,具有很長的栽培繁育歷史,種內(nèi)品種超過20個(gè),而變種紅白忍冬栽培歷史短,可能還沒出現(xiàn)品種間的分化。RNA-seq樣本采用群體RNA,群體內(nèi)的SSR的高多態(tài)性使得拼接所得cDNA的SSR長度更長,出現(xiàn)忍冬SSR比紅白忍冬多的現(xiàn)象。2不同研究對象的est-ssr分析忍冬和紅白忍冬最主要的重復(fù)基序類型為二核苷酸(51.98%,57.45%),其次為三核苷酸(34.61%,30.09%)、六核苷酸(4.99%,7.06%)、五核苷酸、四核苷酸,如表3。其中二核苷酸占了顯著的優(yōu)勢,與蓖麻、鳶尾、丹參、人參、木豆等的研究結(jié)果相符,而更多的植物如水稻、南瓜、三齒蒿、花生、蔓長春花等最主要的重復(fù)基序類型為三核苷酸。然而,由于測序及拼接方法的不同,去除冗余的參數(shù)選擇及SSR搜索軟件的不同,目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)作為既定的SSR識別程式。不同的研究者對EST-SSR的搜尋標(biāo)準(zhǔn)不同,對不同植物重復(fù)類型選擇不同重復(fù)次數(shù)作為識別標(biāo)準(zhǔn),使得研究結(jié)果迥異,如王學(xué)勇等、宋杰等、鄧科君等分別使用在線軟件SSRIT對NCBI上所收載的丹參EST序列進(jìn)行分析,因設(shè)定的識別標(biāo)準(zhǔn)不同,分析結(jié)果出現(xiàn)重大差異,分別認(rèn)為二核苷酸、三核苷酸、二核苷酸為主要的基序類型,并且二、三核苷酸重復(fù)中的類型組成也不同。另一方面,由于不同研究者使用的EST序列來源不同,EST數(shù)據(jù)含量大小不同,分析所得結(jié)論也可能相悖,如李晶晶等、張宇等、Lu等分別對源自NCBI的4000條、19173條、454GS-FLX測序所得的33530條辣椒EST序列進(jìn)行分析,結(jié)果分別為二核苷酸、三核苷酸、三核苷酸重復(fù)占主要類型。本文對于實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理方法均相同的忍冬和紅白忍冬進(jìn)行分析,結(jié)果表明其SSR分布具有統(tǒng)一性。其中二、三、六核苷酸的含量較四、五核苷酸更為豐富,這可能與四、五核苷酸的SSR變異更容易引起移碼突變、受到更強(qiáng)的自然選擇壓力有關(guān)。忍冬和紅白忍冬二核苷酸各基序中,AG/TC出現(xiàn)的頻率最高,分別占二核苷酸總量的53.45%和53.86%,其次為GA/CT,分別為38.34%和39.47%。忍冬和紅白忍冬三核苷酸基序中GAG/TCT出現(xiàn)的頻率最高,分別為15.81%和14.43%,其次為GAA/CTT分別為13.42%和12.74%,AAG/TTC在忍冬和變種紅白忍冬中分別為9.86%和12.03%。在忍冬和紅白忍冬EST序列中均未發(fā)現(xiàn)GC/CG重復(fù)基序及頻率極低的GGC/CCG(<0.1%),這與此前的研究結(jié)果相符。3不同性別est-ssr的比較通過blastN篩選忍冬和紅白忍冬的EST序列,共獲得1280對具有SSR的同源序列對,其中具有差異的SSR有124對(表4)。在124對忍冬與紅白忍冬具差異的SSR中,有87對具重復(fù)次數(shù)差異,可用于PCR擴(kuò)增、凝膠電泳鑒別忍冬及其變種。對比表3和表4可發(fā)現(xiàn),可用于鑒別的EST-SSR分布具有明顯偏好性,忍冬和紅白忍冬EST-SSR均為二核苷酸基序頻率最高,達(dá)50%以上,六核苷酸不及10%;與之形成對比,忍冬與變種差異SSR中,三核苷酸和六核苷酸占主要地位,二核苷酸含量較少,此前,Jung等在研究薔薇EST-SSR時(shí)發(fā)現(xiàn)薔薇的二核苷酸含量最高,并推測主要來自3’UTR區(qū)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅白忍冬和忍冬主要差異SSR位于翻譯區(qū),三核苷酸和六核苷酸基序頻率較高的原因可能是由于不引起移碼突變、對序列翻譯的影響小、受到選擇壓力相應(yīng)小,故而在種內(nèi)編碼區(qū)出現(xiàn)的概率更大。4對引導(dǎo)物的pcr擴(kuò)增利用所選取的15對引物在16個(gè)忍冬個(gè)體、14個(gè)變種紅白忍冬個(gè)體和22個(gè)山銀花外類群的個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共13對候選引物可得到有效的PCR產(chǎn)物,并且均具有多態(tài)性。在13對候選引物中,jp.ssr4、jp.ssr64、jp.ssr65在忍冬、紅白忍冬和山銀花的4個(gè)種間均有區(qū)別,可用于忍冬及其變種的鑒別,并可鑒別出偽品山銀花的種類。聚丙烯酰胺凝膠電泳見圖1。5忍冬和紅忍冬ssr多態(tài)性的特征及其對一個(gè)群體利用13對候選引物分析忍冬及其變種的遺傳多樣性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)每對引物所得的等位基因數(shù)為2~6個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)有2.62個(gè)等位基因,有效等位基因?yàn)?.15個(gè)(表5)。分析結(jié)果表明,忍冬原種與變種等位基因數(shù)、PIC均值、Ho均值和He均值均接近,說明忍冬和紅白忍冬的種內(nèi)遺傳變異相似,暗示兩者栽培歷史的長度未能造成其種內(nèi)遺傳多樣性的差異,從而也說明忍冬EST-SSR的分布頻率高于紅白忍冬更可能是由于SSR識別標(biāo)準(zhǔn)的限制造成的。另一方面,雖然忍冬和紅白忍冬的遺傳多樣性相似,但引物的選擇對遺傳多樣性具有很大的影響,如對于引物jp.ssr42、jp.ssr48、jp.ssr58擴(kuò)增產(chǎn)物,紅白忍冬均顯單態(tài)性,而忍冬在所有引物中均表現(xiàn)出多態(tài)性。PIC值是衡量等位信息含量的理想指標(biāo),當(dāng)PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高多態(tài)性位點(diǎn),0.25<PIC<0.5,該位點(diǎn)為中度多態(tài)性位點(diǎn),PIC<0.25,該位點(diǎn)為低度多態(tài)性位點(diǎn)。除jp.ssr13外,忍冬和紅白忍冬SSR位點(diǎn)都為中度或低度多態(tài)性位點(diǎn),并且忍冬與紅白忍冬SSR位點(diǎn)等位基因數(shù)很低,說明忍冬和紅白忍冬遺傳多態(tài)性低,這可能與忍冬、紅白忍冬均使用扦插繁殖,遺傳變異小有關(guān)。使用Nei等1978年提出的遺傳距離計(jì)算公式分析忍冬和變種紅白忍冬的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離,分別為0.6327和0.4578,兩者遺傳相似性系數(shù)很大,遺傳距離小,甚至低于一些物種的種群內(nèi),這可能也與金銀花采用扦插導(dǎo)致遺傳變異小有關(guān)。6藥養(yǎng)工藝及藥材來源由于EST-SSR多態(tài)位點(diǎn)多,信息含量高,可反映