不同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)提高pc12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

不同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)提高pc12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

由pc12細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)軸突壓能用于研究神經(jīng)退行性疾病和脊柱損傷，也是神經(jīng)內(nèi)涵試驗(yàn)的模型。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是分子生物學(xué)及基因工程關(guān)鍵步驟之一,也是體外研究神經(jīng)細(xì)胞特定基因表達(dá)調(diào)控及遺傳病基因治療的重要技術(shù)之一,但常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低。本研究參照相關(guān)文獻(xiàn),通過(guò)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入氯喹及亞精胺,同時(shí)調(diào)整陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與DNA用量的比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間,實(shí)現(xiàn)提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,且未影響細(xì)胞的正常功能,為PC12細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞基因功能及開(kāi)發(fā)遺傳病治療方案等生物學(xué)研究提供了一種安全、廉價(jià)的新方法。1其他聚合物催化劑主要試劑:PC12細(xì)胞(AmericanCultureCollection),RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma公司),Lipofectamine2000(Invitrogen公司),FuGENEHD(Roche公司),PolyJet(SignagenLaboratoies公司),LipofectamineLTXandPlus(Invitrogen公司),pEGFP-N1(BDBiosciences公司),氯喹(Sigma公司),亞精胺(Sigma公司),Ⅰ型牛膠原蛋白(BDBiosciences公司),神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)(Peprotech公司),噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)。Axiovert100M倒置熒光顯微鏡(CarlZeiss公司),MetaMorph圖像分析處理軟件(MolecularDevices公司),EL808酶標(biāo)儀(Bio-TekInstrument公司)。1.2陽(yáng)離子脂質(zhì)體/dna復(fù)合材料nmf和細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞活性檢測(cè)1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞培養(yǎng)參照相關(guān)文獻(xiàn),細(xì)胞密度至70%左右時(shí)進(jìn)行傳代,傳至2~3代的PC12細(xì)胞備用。1.2.2PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)的方法,轉(zhuǎn)染的基本步驟:將4μLLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入75μL不含血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基中混勻,同時(shí)將1μg質(zhì)粒pEGFP-N1加入150μL不含血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基中孵育5min后將兩溶液混勻,室溫靜置30min,另將含(或不含)36mmol/L氯喹、32μmol/L亞精胺的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基75μL加入上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物,移去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入以上陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物,培養(yǎng)4h后再棄去上述含陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)液,換成新鮮含5%胎牛血清、10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,每室300μL。再培養(yǎng)48h,然后在Axiovert100M倒置熒光顯微鏡,物鏡40×和目鏡10×放大倍數(shù)下拍照及計(jì)數(shù)分析。見(jiàn)圖1(封三)。1.2.3四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法,用MTT試驗(yàn)分別測(cè)定對(duì)照孔、在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加(或不加)氯喹與亞精胺孔的PC12細(xì)胞活性。1.2.4PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)試驗(yàn)按文獻(xiàn)方法,PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含1%胎牛血清、含(或不含)100ng/mL神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)5d后,在倒置熒光顯微鏡物鏡40×和目鏡10×放大倍數(shù)下拍照及計(jì)數(shù)分析見(jiàn)圖2(封三)。1.2.5轉(zhuǎn)染效率與神經(jīng)軸突判定及統(tǒng)計(jì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為轉(zhuǎn)染效率。參照文獻(xiàn)方法,用MetaMorph圖像分析處理軟件計(jì)數(shù)并測(cè)量PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突的長(zhǎng)度。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1pc12細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)質(zhì)粒pEGFP-N1的用量為1μg時(shí),Lipofectamine2000用量相對(duì)較低時(shí),PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine2000用量呈正相關(guān),但隨著Lipofectamine2000用量超過(guò)4μL,其毒副作用逐漸明顯,導(dǎo)致PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率逐步降低,且綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的死亡率明顯增加,本研究結(jié)果表明,對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染,DNA∶Lipofectamine2000用量比例應(yīng)控制在1∶4。2.2關(guān)于“法院”當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間分別為1、2、4、8、24h時(shí),PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在未達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間前,轉(zhuǎn)染效率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,4h達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率,但在超過(guò)4h后轉(zhuǎn)染時(shí)間后,轉(zhuǎn)染效率則會(huì)緩慢降低。隨著氯喹、亞精胺加入濃度的增加,PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率也隨之增加,當(dāng)氯喹、亞精胺加入終濃度分別增至9μmol/L和8μmol/L時(shí),PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高,轉(zhuǎn)染效率為40.5%。2.4mtt檢測(cè)結(jié)果PC12細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入終濃度為9μmol/L氯喹與8μmol/L亞精胺前、后MTT試驗(yàn)吸光度(590nm)分別為(0.466±0.042)與(0.451±0.038),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明PC12細(xì)胞的活性無(wú)影響。2.5亞精胺、氯喹的用量對(duì)pc12細(xì)胞功能的影響轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000對(duì)轉(zhuǎn)染前后的PC12細(xì)胞及經(jīng)NGF誘導(dǎo)后產(chǎn)生的神經(jīng)軸突長(zhǎng)度無(wú)影響。氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)數(shù)量與長(zhǎng)度無(wú)影響;也間接表明在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入9μmol/L氯喹及8μmol/L亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞的功能無(wú)影響。見(jiàn)表1。2.6不同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)pc12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較本文以pEGFP-N1為報(bào)告基因,用本法與常用的FuGENE、PolyJet、LipofectamineLTXandPlus、Lipo-fectamine2000等4種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較,結(jié)果:本法的PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為40.5%,其它四種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為10.5%、8.6%、11.8%及15.3%。本法對(duì)PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他4種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。3亞精胺對(duì)氯喹pc12細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響PC12細(xì)胞具有類似神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變及生理學(xué)特征而作為神經(jīng)研究的模式細(xì)胞。氯喹、亞精胺能明顯提高PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,且不影響PC12細(xì)胞的活性與正常功能,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1，8]。氯喹是一種疏水性的弱堿,在PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中能進(jìn)入細(xì)胞吞噬溶酶體,在酸性環(huán)境下被質(zhì)子化,隨著質(zhì)子化的氯喹在吞噬溶酶體的累積,吞噬溶酶體開(kāi)始腫脹,其包膜穩(wěn)定性破壞,導(dǎo)致陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物釋放入細(xì)胞漿,同時(shí),氯喹抑制吞噬溶酶體酸化與成熟,阻止陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物在溶酶體中的降解,轉(zhuǎn)染過(guò)程中氯喹能提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與上述氯喹的作用機(jī)制有關(guān)。亞精胺是一種多胺類制劑能通過(guò)增強(qiáng)DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄作用來(lái)提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)能增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度。當(dāng)DNA:Lipofectamine2000比小于1∶4時(shí),Lipofectamine2000用量相對(duì)過(guò)多,N∶P比增加,陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物表面所帶的凈正電荷增多,PC12轉(zhuǎn)染效率也隨之增加,但對(duì)PC12細(xì)胞毒性作用也隨之增強(qiáng),這