第十章層析分離技術(shù)

第十章層析分離技術(shù)1903-1906年，俄國植物學(xué)家MichaelTswett利用碳酸鈣分離色素的時候發(fā)現(xiàn)了層析現(xiàn)象。一、概述◆后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離?！?944年出現(xiàn)紙層析?！魧游龇ú粩喟l(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析技術(shù)，又稱色譜技術(shù)，是一種物理分離方法，利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定相，另一個相則流過此固定相并使各組分以不同速度移動，從而達到分離的目的。二、基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定相，另一相流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的?！艄潭ㄏ啵?/p>

固定相是層析的一個基質(zhì)，可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用?！袅鲃酉啵?/p>

在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展開劑。三、層析法的分類兩相所處狀態(tài)氣相(氣-液;氣-固)層析液相(液-液;液-固)層析分離機制薄層吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析操作形式柱層析薄層層析紙層析薄膜層析四、常見的層析技術(shù)1柱層析(1)原理利用混合物中各組分在層析介質(zhì)中的吸附或溶解性能的不同或親和作用性能的差異,使混合物的溶液流經(jīng)該介質(zhì)時，待測組分與層析介質(zhì)進行反復(fù)的吸附或分配,從而將各組分分開。(2)分類吸附柱色譜（常用）分配柱色譜(3)組成(4)操作步驟A準(zhǔn)備材料柱子層析材料B裝柱先關(guān)閉柱出口，用溶劑灌注至1/3體積，并使支持板下的“死體積”不存在氣泡，再慢慢地向溶劑中加層析材料，注意不要使氣泡留在柱內(nèi)。為避免分層，最好一次裝完到需要的高度。最后加一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面。C上樣上樣前，加溶劑使樣品溶解或?qū)悠芬哼^濾，然后將樣品小心加到層析床的表面，打開旋塞使液面與床面齊，然后連接溶劑池，保持一定高度的液面。D洗脫用適當(dāng)?shù)南疵撘喊迅鹘M分依次從柱子上洗脫下來。一般情況下，使用梯度洗脫法，即先用一種洗脫液將一個組分洗脫下來，然后更換新洗脫液洗脫另一個組分。也可以逐漸改變?nèi)軇┑男再|(zhì)，使洗脫液形成一個離子強度、pH或極性遞增梯度從而使各組分依次被洗脫下來。E

收集及分析可以用人工的方法將流出液收集到一系列的試管中或使用自動部分收集器收集流出液。收集完畢后可以通過合適的方法餾分進行檢測。緩沖液管柱梯度制造器監(jiān)視器記錄器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptor膠體A自動收集器薄層層析（Thinlayerchromatography)a原理利用吸附劑對樣品中各成分吸附能力的不同和展開劑對吸附成分解吸能力的不同，使各成分達到分離。b操作準(zhǔn)備薄層板點樣展開檢識取7.5×2.5cm左右的載玻片2片，洗凈晾干。稱一定量的硅膠加入0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成均勻的糊狀涂于潔凈的載玻片上，制成厚薄均勻的薄層板室溫放置0.5h放入烘箱（110℃）恒溫0.5h取出，冷卻后備用取用上述方法制好的薄層板用毛細管吸少許樣品液距離薄層板一端約1cm處點樣將點好的樣晾干或吹干放入展開槽中展開取出色層板實例葉綠素的柱色譜分離

綠色植物的葉和莖中含有胡蘿卜素(C40H56)、葉黃素(C40H56O2)、葉綠素a(C55H72MgN4O5)和葉綠素b

(C55H70MgN4O6)。這些色素易被80%丙酮或石油醚－乙醇混合液萃取，從植物莖、葉中浸提出來。對于浸提出來的色素混合物，然后采用氧化鋁柱色譜(LCC)進行分離。原理：操作流程取青菜葉過濾用20mL95%乙醇浸泡8h靜置分層放出水層加10mL石油醚加50mLH2O水洗醚層加無水硫酸鈉干燥濕法裝柱加樣品加石油醚-丙酮溶液洗脫收集洗脫液提取液置于分液漏斗硅膠柱操作:(示教)薄層層析:（示教）提問:1如何裝硅膠柱?2薄層板如何制作?2凝膠柱層析凝膠層析又稱凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析，等等。以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各組分的液相色譜方法。

凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來?；驹頌榱司_的衡量混合物中各成分在柱內(nèi)的洗脫行為，采用分配系數(shù)Kd度量。

Kd=(Ve-Vo)/ViVe＝某一成分從層析柱內(nèi)完全被洗脫出來時洗脫液的體積Vo＝層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的總?cè)莘eVi＝層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部的總?cè)莘e1外水體積V0:凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即凝膠顆粒間液體流動相的體積。2內(nèi)水體積：凝膠顆粒中孔穴的體積，即是凝膠層析中固定相體積。3基質(zhì)體積：凝膠顆粒實際骨架體積。4柱床體積：凝膠柱所能容納的總體積。Vt＝Vo＋Vi＋VgVt＝Vo＋ViKd=0，Ve=V0分子被完全排阻于凝膠顆粒之外，分布于流動相之中。Kd=1，Ve=V0+Vi分子均勻分布在流動相和固定相中0<Kd<1分子部分受阻Kd=(Ve-Vo)/Vi凝膠介質(zhì)天然凝膠（如瓊脂糖凝膠）人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）是一種特殊的分散體系，其中膠體顆粒分子鏈以化學(xué)鍵連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，液體或氣體充滿于結(jié)構(gòu)空隙之中。葡聚糖凝膠的特點：1具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。2多聚糖鏈之間通過1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。3葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大4具有弱酸性，洗脫緩沖液中加入NaCl提高離子強度。操作步驟:1層析柱的選擇◆層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇?！糸L度不超過100cm，為得到高分辨率，可串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25～1:100之間。2凝膠前處理溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。堿洗：用0.5NNaOH

溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。酸洗：用0.5NHCl

溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。3裝柱將層析柱垂直固定，加入適量溶劑排走空氣。將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高時打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。4上樣A裝好層析裝置后，打開下端出口，使溶液流出至剛好達到凝膠膠面；B沿柱壁緩慢加入樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁；C打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫；D用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。5凝膠的再生

用過的凝膠經(jīng)0.5N的NaOH和HCl溶液分別處理后可以恢復(fù)其性能。6凝膠的保存A濕法保存防腐劑硫柳汞,0.005%,使用時水洗除去;加入氯仿,使用時60度水浴除去;60~70%乙醇溶液。B干法保存凝膠抽去過量水加入乙醇（0~95%）抽干60~80℃烘干凝膠層析分離血紅蛋白和魚精蛋白（示教）SephadexG-50凝膠柱及樣品準(zhǔn)備上樣洗脫觀察紅色的色帶(分子量大的血紅蛋白)先洗脫下來,黃色的色帶(分子量小的DNP-魚精蛋白)后洗脫下來注意勿攪動床面,避免干柱4離子交換層析概述離子交換劑原理操作步驟（1）概述交換離子層析是以離子交換劑為固定相，利用流動相中組分離子與固定相上的離子進行可逆結(jié)合的能力大小而使化合物分離開來的一種層析技術(shù)。早在古希臘時期人們就會用特定的黏土純化海水.算是比較早的離子交換法.這些黏土主要是沸石。Sober和Peterson于1956年首次將離子交換基團結(jié)合到纖維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發(fā)展。

具有成本低、操作方便、提取率高、設(shè)備簡單等優(yōu)點。主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶等大極性物質(zhì)的分離。（2）離子交換劑離子交換樹脂是人工合成的不溶于酸、堿和有機溶劑的高分子聚合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有離子交換的能力。包括活性基團和固定基團兩部分，活性基團能夠移動，可以與外界離子進行可逆地交換，固定基團構(gòu)成樹脂的骨架。通式為：R-活性基團

分類陽離子交換樹脂強酸性陽離子交換樹脂中酸性陽離子交換樹脂弱酸性陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂強堿性陰離子交換樹脂中堿性陰離子交換樹脂弱堿性陰離子交換樹脂陽離子交換劑

陽離子交換劑中的可解離基團是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基團。

交換劑在交換時反應(yīng)如下：

R-COOH＋Na+R-COONa＋H+

陰離子交換劑

陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺(-NH2)、仲胺(-NHCH3)、叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2]等堿性基團。（3）交換原理(4)操作步驟A樹脂的前處理樹脂干粉加水浸泡2h減壓抽氣泡去離子水洗至澄清加2NHCl攪拌4h水洗至中性加2NNaOH攪拌4h水洗至中性加酸或堿轉(zhuǎn)型(備用)B裝柱玻璃柱子垂直固定樹脂放入燒杯加水?dāng)嚢璧谷氪怪钡牟Ａе鶅?nèi)樹脂沉降備用注:樹脂在柱內(nèi)均勻分布。C上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)小心加入樣品D洗脫及收集選擇合適洗脫液對樣品進行洗脫用自動部分收集器自動或手動收集，合并相同的管。5親合層析概述基本原理操作步驟應(yīng)用（1）概念利用生物分子之間專一的親和力而進行分離的層析技術(shù)。對蛋白質(zhì)、酶等生物大分子特別有效。（2）基本原理——生物專一吸附要成功地利用親合層析技術(shù)分離純化物質(zhì)需要具備：良好的固相載體配基：強的親和力，如抗原-抗體、激素-受體、DNA-互補的DNA或RNA、凝集素-糖蛋白。耦合反應(yīng)：三要素有豐富可供活化的化學(xué)基團，并在溫和條件下與配基共價結(jié)合②惰性的，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；③具有良好的機械性能和理化穩(wěn)定性常見的載體商品：配基具有的特點：對欲純化的生物物質(zhì)具有專一親和性；具有被修飾的功能基團。（3）操作步驟尋找配基共價結(jié)合到載體上裝入層析柱內(nèi)上樣洗滌雜質(zhì)洗脫收集再生特異