蛋白質(zhì)測定的主要原理、方法及三聚氰胺的檢測方法

蛋白質(zhì)測定的主要原理、方法及三聚氰胺的檢測方法蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，相對分子質(zhì)量很大，大部分高達(dá)數(shù)百萬，它們由20中氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來，所含的主要化學(xué)元素為C、H、0、N,在某些蛋白質(zhì)中含微量的P、Cu、Fe、I等元素。不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種蛋白質(zhì)的含氮量也不同。根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和成分，測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)的含量；另一種是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。目前常用的有四種經(jīng)典方法，即凱氏定氮法，雙縮尿法(Biuret法)、Folin—酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。其中考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)法和Folin—酚試劑法(Lowry法)法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10?20倍，比雙縮尿法(Biuret法)法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。一、 常量凱氏定氮法原理：消化：樣品與硫酸一起加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在酸性溶液中。在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330°C，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400°C,加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。為了加速反應(yīng)過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。操作步驟：準(zhǔn)確稱取樣品中0.50-2.00gf于500ml凱氏瓶中一加10g無水KS0-加0.5gCuS0-加2 4 420mlHS0-在通風(fēng)櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，24將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中-繼續(xù)消化30分鐘-至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻-加200ml水-連接蒸餾裝置-用硼酸作吸收液-在凱氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50%Na0H-立即接好定氮球一加熱一至到凱氏瓶內(nèi)殘液減少到三分之一時(shí)，取出用水沖洗一用0.1NHCl滴定。計(jì)算：總氮量%= (N(V-V)X0.014)/WX100二、 雙縮脲法(Biuret法)原理：脲小心加熱至150~160攝氏度時(shí)，兩個(gè)分子的脲脫去一個(gè)氨分子生成雙縮尿，可于銅離子形成有色復(fù)合物，成為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有兩個(gè)以上的肽鍵，與雙縮脲的結(jié)構(gòu)相似，也由雙縮脲反應(yīng)（而氨基酸中沒有此結(jié)構(gòu)），因此，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與二價(jià)銅離子（如硫酸銅）形成可溶性的紫色復(fù)合物（在540~560nm波長范圍有最大吸收），在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及氨基酸成分無關(guān)。操作步驟：試劑：（1）甘油作為穩(wěn)定劑：取1OmllONKOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時(shí)加入4%CuS050ml。4（2）酒石酸鈉作穩(wěn)定劑，吸10ml10NKOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時(shí)加入4%CuSO液4Oml。4配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。按蛋白質(zhì)含量40、50、60、70、80、90、100和110mg分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣與8支50ml納氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，然后再用試劑（1）或（2）準(zhǔn)確稀釋至50ml，振搖10分鐘，靜置1小時(shí)，取上層清液離心5分鐘，取；離心5分鐘，取離心分離后的透明液與比色皿中，在560nm波長下一蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測定個(gè)溶液的吸光度，以蛋白質(zhì)的含量為從坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測定：準(zhǔn)確稱取樣品適量（即使得蛋白質(zhì)含量在40~110mg之間）于50ml納氏比色管中，加入1ml四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測定其吸光度。用所測得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)mg數(shù)，進(jìn)而求得蛋白質(zhì)含量。計(jì)算X=（m*100）/m式中：X為蛋白質(zhì)的含量（mg/100g）iQ］為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)毫克數(shù)（mg）m為樣品質(zhì)量（g）三、 Folin—酚試劑法（Lowry法）原理：這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。,Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個(gè)測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。操作步驟：試劑：試劑甲：10克NaCO,2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaCHO?4H0)。溶解于5002 3 446 2毫升蒸餾水中。0.5克硫酸銅(CuSO?5HO)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(A)42與1份(B)混合，即為試劑甲。(2)試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(NaWO?2HO),25克鉬酸鈉(NaMoO?2HO)2 4 2 2 4 2及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰(LiSO),50毫升蒸餾水及24數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250mg/ml)。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫(20?25°C)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑)，同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個(gè)樣品。樣品的測定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質(zhì)20~250微克)，按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意：由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度(相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì))。四、 紫外吸收法280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用lcm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為lmg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A1%1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1%1cm,入稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度二（A280'10）/A1%1cm,280nm（mg/ml）（Q1%濃度》10mg/ml）若查不到待測蛋白質(zhì)的A1%1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。280nm和260nm的吸收差法核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260?1.8純核酸的光吸收比值：A280/A260?0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45XA280-0.74XA260（mg/ml）此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20?100mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：吸收差D=A215-A225以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知樣品的吸收差,即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。本方法在蛋白質(zhì)濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH）4SO以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1NNaOH,0.1M乙24酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。肽鍵測定法蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50~500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238,以A238為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)lmg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點(diǎn)是：（1） 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2） 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。操作步驟試劑：（A） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白（BSA）,配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（B） 考馬斯亮蘭G—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。標(biāo)準(zhǔn)方法:（1） 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。按要求將未知樣品加入第8、9、10管。（2） 加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2）加5.0mlG—250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時(shí)間浸泡。（3） 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。微量法:當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10—100mg/ml），可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0mlH』考馬斯亮藍(lán)G—250試劑仍加5.0ml,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595nm的光吸收值。目前檢測三聚氰胺的方法很多，高效液相色譜法，液質(zhì)和氣質(zhì)聯(lián)用是較常用的方法。其他方法有方法包括：GC-MS,Spectra-Quad線檢測，超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法，反相高效液相色譜法，高效液相色譜-二極管陣列法，，高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MSMS）等。因?yàn)橐郧白鲞^液相的實(shí)驗(yàn)，較了解實(shí)驗(yàn)原理，所以下面詳細(xì)介紹高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。高效液相色譜法（HPLC）（1）原理：試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標(biāo)法定量。（2） 提?。阂簯B(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等稱取2g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min,再振蕩提取10min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液,加入5mL水混勻后做待凈化液。（3） 凈化：混合型陽離子交換固相萃取柱（MCX）使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化，將待凈化液轉(zhuǎn)移至萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL5%氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50°C下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于0.4g樣品）用1mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min,過0.2um微孔濾膜后，供HPLC測定。高效液相色譜測定：色譜柱：C8柱，250mmX4.6mm（i.d.），5um,或相當(dāng)者；C18柱，250mmX4.6mm（i.d.）,5um,或相當(dāng)者。流動(dòng)相：C8柱，離子對試劑緩沖液（10mM辛烷磺酸鈉-10mM檸檬酸，pH3.0）-乙腈（85+15，體積比），混勻。C18柱，離子對試劑緩沖液（10mM辛烷磺酸鈉-10mM檸檬酸，pH3.0）-乙腈（90+10,體積比），混勻。流速：1.0mL/min。?柱溫：40C。波長：240nm。?進(jìn)樣量：20uL。（檢測波長240nm,保留時(shí)間13.6min,C8色譜柱）液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（1）原理：試樣用三氯乙酸溶液提取,經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后,用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證,外標(biāo)法定量。（2）提?。╝）液態(tài)奶、奶粉