烏梅丸拆方治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究

烏梅丸拆方治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究

潰瘍性胃炎（iu）是一種腸管疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉、粘膜膿血便、腹痛、急性腹瀉和后重量。目前,西醫(yī)治療潰瘍性結(jié)腸炎以氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主,但效果不甚理想且容易復(fù)發(fā)。潰瘍性結(jié)腸炎根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸入中醫(yī)學(xué)“腸澼”、“下利”、“痢疾”等范疇,在中醫(yī)辨證論治思想的指導(dǎo)下,其臨床療效顯著。烏梅丸、白頭翁湯、半夏瀉心湯等經(jīng)典方劑已被臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明有顯著療效。潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)以寒熱錯(cuò)雜證最多,治療以烏梅丸加減應(yīng)用最多,烏梅丸的組方體現(xiàn)中醫(yī)多種治法,根據(jù)寒熱藥性及治法的不同可拆方為以下五組:(1)溫?zé)峤M:細(xì)辛、干姜、桂枝、附子、蜀椒;(2)苦寒組:黃連、黃柏;(3)補(bǔ)益組:人參、當(dāng)歸;(4)收斂組:烏梅;(5)寒熱并用組:細(xì)辛、干姜、桂枝、附子、蜀椒、黃連、黃柏。本實(shí)驗(yàn)通過觀察烏梅丸及其拆方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用,探討不同治法的作用機(jī)制及寒熱并用在烏梅丸方中的配伍意義。材料和方法1.材料表面1.1動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠115只,體質(zhì)量(220±20)g,合格證號(hào):SCXK(陜)2007-001,西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2特效藥1.3測(cè)定活性化合物的測(cè)定2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國SIGMA公司)。髓過氧化物酶(MPO)、白介素10(IL-10)(上海西唐生物科技有限公司)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。前列腺素2(PGE2)(陜西永屹生物科技公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。水合氯醛(上海山浦化工有限公司)。1.4儀器、檢測(cè)系統(tǒng)酶標(biāo)儀ELX808(美國Bio-Tek公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-Ⅱ,寧波新芝生物科技公司);721分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器公司);圖像采集系統(tǒng)(NIKON.ACT-1DXM1200日本尼康公司);光學(xué)顯微鏡(蔡司光學(xué)儀器(上海)公司)。2.方法2.1用于制造模型藥物的制備將5%的TNBS水溶液與無水乙醇按比例配制成50%的TNBS/乙醇溶液;水合氯醛晶體溶于蒸餾水分別配制成5%和10%的混懸液。2.2人參中藥烏梅丸方:烏梅16g,細(xì)辛6g,干姜10g,桂枝6g,附子6g,蜀椒4g,黃連16g,人參6g,當(dāng)歸4g,黃柏6g。各拆方按原方比例及文獻(xiàn)報(bào)道劑量配制,含附子的先煎30min;大承氣湯:大黃12g,厚樸24g,枳實(shí)12g,芒硝9g,先煎厚樸、枳實(shí),后下大黃,溶入芒硝;各方煎煮后過濾及水浴蒸發(fā)制成1g/mL生藥的水煎液,高溫滅菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3大承氣湯兩組聯(lián)合給藥115只SD雄性大鼠分為正常組、模型組、烏梅丸組、溫?zé)峤M、寒涼組、寒熱并用組、補(bǔ)益組、收斂組。正常組10只,其余各組均15只。除正常組外,其余各組先進(jìn)行脾胃虛寒模型,造模方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行改進(jìn):各大鼠按照大承氣湯每日9.5g/kg灌胃,灌胃10d后進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎的造模。造模8h后,各組開始灌胃給藥,給藥劑量參考文獻(xiàn)按10倍人體劑量給藥,烏梅丸組每日給烏梅丸方13.3g/kg(相當(dāng)于原生藥量);溫?zé)峤M給溫?zé)岱?.33g/kg;苦寒組給苦寒方3.67g/kg;收斂組給收斂方267g/kg;補(bǔ)益組給補(bǔ)益方水煎劑1.67g/kg;寒熱并用組給寒熱方9.0g/kg;空白組、模型組均給予0.9%氯化鈉溶液10mL/kg。共10d。2.4指標(biāo)的檢測(cè)2.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0處理數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示,采用方差分析;頻數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.一般行為2.采用“五梅”法對(duì)脆脹性腸球菌的死亡率、體重、腸指數(shù)和潰瘍面積的影響3.對(duì)大鼠進(jìn)行tnf-和il-1含量的影響見表2。與空白組比較,模型組大鼠體溫、TNF-α、IL-1含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、寒熱并用組、寒涼組、補(bǔ)益組大鼠體溫、TNF-α、IL-1含量均顯著降低(P<0.05),以烏梅丸組最顯著,其次為寒熱共用組和寒涼組,收斂組僅表現(xiàn)出趨勢(shì);溫?zé)峤M大鼠體溫顯著升高,TNF-α、IL-1含量降低(P<0.05)。4.各組大鼠的脾指數(shù)、尾腺指數(shù)的比較見圖1。與正常組比較,模型組大鼠脾指數(shù)升高(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、寒熱并用組、溫?zé)峤M、寒涼組和補(bǔ)益組脾指數(shù)均降低(P<0.05),其中以烏梅丸組和寒熱并用組作用最明顯(P<0.05),收斂組僅表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。見圖2。與正常組比較,模型組大鼠胸腺指數(shù)降低(P<0.05);與模型組比較烏梅丸組、寒熱并用組、溫?zé)峤M和補(bǔ)益組胸腺指數(shù)升高(P<0.05),且組間無差異;寒涼組和收斂組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.各組大鼠結(jié)腸組織il-10、pge2及mpo活性比較見表3。與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織IL-10含量降低(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、寒熱并用組、溫?zé)峤M和補(bǔ)益組大鼠結(jié)腸組織IL-10含量升高(P<0.05),以烏梅丸組最顯著,寒涼組和收斂組僅表現(xiàn)出趨勢(shì)。見表3。與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織PGE2含量及MPO活性升高(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、寒熱并用組和溫?zé)峤M大鼠結(jié)腸組織PGE2含量降低(P<0.05);烏梅丸組、寒熱并用組、溫?zé)峤M、寒涼組、補(bǔ)益組大鼠結(jié)腸組織MPO活性降低(P<0.05),烏梅丸組、寒熱并用組和補(bǔ)益組最為明顯。6.3.實(shí)行《決定》第5款第5款第5.55.實(shí)行《決定》第5款第5.5.5.5.5.5.5.5%逐步形成見圖3。與正常組比較,模型組大鼠血清SOD活性降低(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、溫?zé)峤M、寒熱并用組和補(bǔ)益組大鼠血清SOD活性升高(P<0.05),補(bǔ)益組作用最強(qiáng),烏梅丸組、寒熱并用組和溫?zé)峤M次之,寒涼組和收斂組無差異。7.大量炎性浸漬見圖4。正常組黏膜表面光滑,上皮結(jié)構(gòu)完整,大腸腺清晰,杯狀細(xì)胞形態(tài)正常,無炎癥細(xì)胞浸潤;模型組黏膜表面起伏不平,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,腺體萎縮,排列紊亂,杯狀細(xì)胞形態(tài)改變,有膿腫形成,可見潰瘍面形成或黏膜大面積缺損,嚴(yán)重的甚至損害黏膜下層,表現(xiàn)為黏膜下層大量炎性浸潤;烏梅丸組及寒熱并用組結(jié)腸組黏膜仍可見炎性細(xì)胞浸潤,但明顯少于模型組,仍可見腺體及杯狀細(xì)胞,其余各組仍可見大量炎性細(xì)胞浸潤,甚至達(dá)黏膜下層,腺體結(jié)構(gòu)不完整,杯狀細(xì)胞數(shù)目明顯減少。冷血藥治療對(duì)噬菌性結(jié)腸的作用機(jī)制UC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,免疫功能紊亂引起的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡和炎癥介質(zhì)的釋放被認(rèn)為是UC的主要機(jī)制之一。有研究表明,TNF-α及IL-1β則在UC腸道黏膜炎癥的擴(kuò)大中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。IL-10能抑制激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子和趨化因子,在UC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病密切相關(guān)的炎癥介質(zhì)主要有花生四烯酸代謝產(chǎn)物、血小板活性因子等。PGE2能增加血管通透性引起組織水腫,使白細(xì)胞趨化、聚集,直接加重炎癥反應(yīng)。氧自由基的形成和抗氧化的失衡在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中也起著重要的作用。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中因免疫系統(tǒng)紊亂會(huì)引起脾臟腫大和胸腺萎縮,能反映炎癥程度的MPO活性也相應(yīng)的升高。方從法出,法隨證立,烏梅丸方的配伍體現(xiàn)了寒熱并用的治法。其目的是雙向調(diào)節(jié)、平衡協(xié)調(diào),利用藥物之性去糾正諸病證之偏,從而恢復(fù)“陰平陽秘”的正常狀態(tài)。由于寒、熱是相互矛盾、水火不容的,使人容易質(zhì)疑寒熱性質(zhì)相反的證侯能否同時(shí)并存,也易認(rèn)為寒熱藥物并用于同一處方其藥性容易相互抵消。藥物的寒熱藥性確立是根據(jù)藥物作用于人體后所產(chǎn)生的反應(yīng)來概括的,是有相對(duì)性的,其作用不一定是對(duì)立的,通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),寒熱藥物在治療潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)既有共性,又有個(gè)性。共性主要表現(xiàn)為兩者均能降低大鼠結(jié)腸指數(shù)、潰瘍面積、結(jié)腸組織TNF-α、IL-1含量以及MPO活性,個(gè)性主要表現(xiàn)為寒涼組能對(duì)抗造模初期產(chǎn)生的體溫升高,在降低結(jié)腸組織TNF-α、IL-1含量和MPO活性方面作用突出。溫?zé)峤M則主要在對(duì)抗胸腺萎縮,升高結(jié)腸組織IL-10含量,降低PGE2含量及抗氧化方面作用突出。對(duì)大鼠死亡率的影響,單用溫?zé)崴幵谠炷３跗谀芤鸫笫篌w溫急劇升高,甚則導(dǎo)致大鼠因體溫過高,炎癥加劇而死亡;單用寒涼藥在造模初期雖能有效降低升高的體溫,但病程發(fā)展過程中可導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量降低,部分大鼠因體質(zhì)量過低消耗性死亡;而寒熱配伍后則能抵消這種不利的作用,有效的降低體溫,控制炎癥且能對(duì)抗體質(zhì)量減輕,提高大鼠生存率。寒熱配伍在減小潰瘍面積,維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控平衡和抑制炎癥介質(zhì)的釋放,對(duì)抗脾腫大和胸腺減小及抗氧化方面均顯示出了協(xié)同和增效的作用。因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷,寒熱配伍是烏梅丸方的主要配伍形式,通過寒熱配伍既可以彌補(bǔ)單用寒涼藥或溫?zé)崴幬锏牟蛔?又有顯著的協(xié)同增效作用。補(bǔ)益組在造模初期降溫作用雖不明顯,但能有效的阻止動(dòng)物死亡,其作用還表現(xiàn)在增加造模大鼠體質(zhì)量,對(duì)抗胸腺萎縮,升高結(jié)腸組織IL-10含量,降低MPO含量以及抗氧化等方面,對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療起到了增效和輔助作用,收斂組對(duì)細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的影響不明顯。本實(shí)驗(yàn)采用病證結(jié)合動(dòng)物模型,以藥物寒熱藥性和中醫(yī)治法為出發(fā)點(diǎn),對(duì)烏梅丸治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行拆方研究,觀察不同治法、寒藥和熱藥對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的影響,初步揭示了不同治法和寒、熱藥性藥物對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。中藥的多成分和方劑配伍后成分變化的復(fù)雜性決定了方劑作用的途徑是多方面,多靶點(diǎn)的,因此烏梅丸的拆方還應(yīng)從多種實(shí)驗(yàn)方法、多層級(jí)及不同角度(如烏梅丸拆方對(duì)胃腸功能,疼痛和胃腸道菌群的影響等)探尋其作用機(jī)制。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示收斂組對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用不明顯,而烏梅為該方君藥,用量最大,為歷代醫(yī)家治療“下利”常用藥物,因此,還需更深層次的研究,以探尋其治療作用機(jī)制。造模6h后,大鼠均存活,相繼出現(xiàn)膿血便,黏液便,消瘦,懶動(dòng),拱背,扎堆,豎毛,毛色晦暗不潔,拖尾,3d內(nèi)多出現(xiàn)扭體動(dòng)作,考慮為腹痛。見表1。與正常組比較,模型組大鼠死亡率、結(jié)腸指數(shù)、潰瘍面積均顯著升高(P<0.05),體質(zhì)量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,烏梅丸組、寒熱并用組和補(bǔ)益組大鼠死亡率均降低(P<0.05);烏梅丸組、寒熱并用組和補(bǔ)益組大鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05);各拆方組大鼠結(jié)腸指數(shù)均降低,其中以烏梅丸組和寒熱并用組最顯著(P<0.05);烏梅丸組、寒熱并用組、寒涼組、溫?zé)峤M潰瘍面積均減小(P<0.05),以烏梅丸組最明顯。烏梅丸、大承氣湯藥物購于陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房。2.4.1造模6h后電子溫度計(jì)測(cè)大鼠肛溫,連測(cè)3d;末次給藥后大鼠稱重;統(tǒng)計(jì)各組大鼠的死亡數(shù),分析死亡原因;一般行為學(xué)觀察。2.4.2血清生化指標(biāo)的檢測(cè):末次給藥后,腹腔注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉,心臟采血,根據(jù)SOD劑盒說明書測(cè)血清SOD活力。2.4.3胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)及潰瘍面積的稱量和計(jì)算:采血后立即剖取胸腺、脾臟及肛門上4-10cm間腸段,冰0.9%氯化鈉溶