反相高效液相色譜分離制備多肽

反相高效液相色譜分離制備多肽

1多肽的分離純化和制備隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了幾種多媒體藥物，多媒體藥物在臨床醫(yī)學(xué)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。自從發(fā)明固相法化學(xué)合成多肽以來,有關(guān)各種活性多肽的化學(xué)合成有了很大發(fā)展,但產(chǎn)物成分比較復(fù)雜,一般是以目標(biāo)多肽為主的幾種結(jié)構(gòu)相似的多肽混合物,因此,對(duì)這一混合物的分離純化一直是一個(gè)重要的研究課題,對(duì)其分離純化的最優(yōu)化研究就顯得格外重要。此外,提供高純度的多肽樣品,對(duì)于其物化性質(zhì)、生物活性及其醫(yī)藥功能的研究具有重要的作用。從現(xiàn)代分離科學(xué)理論得出,色譜和電泳是目前所知的分離效果最佳的兩種方法。電泳僅能用于分離而不能用于多肽的制備。反相高效液相色譜(RPLC)具有分離效果好、分辨率高、回收率高的特點(diǎn),在多肽的分離純化和制備中備受青睞,因此,RPLC是目前分離純化和制備多肽的主要手段。本文擬用RPLC對(duì)化學(xué)合成的32肽和21肽進(jìn)行分離、純化和制備。2實(shí)驗(yàn)部分2.1反相色譜填料的填充SCL-10AVP液相色譜儀(日本島津公司),包括系統(tǒng)控制器、LC-10ATVP色譜泵、進(jìn)樣閥、SPD-M10AVP二極管陣列檢測(cè)器,CLASS-VP5.33色譜工作站。色譜柱為200×4mmI.D.的不銹鋼管,用勻漿法裝填德國(guó)進(jìn)口Nucleosil4000-7C18反相色譜填料。KQ-250型超聲波清洗器(昆山市淀山湖檢測(cè)儀器廠),TLL-C臺(tái)式冷凍離心機(jī)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠),BarnsteadE-Pure純水器(美國(guó)Barnstead公司)。2.2nh2-glu-gly-gly-ala-gly-ala-cys-gly-ala-ala-trt-ala-ala-cohs色譜純乙腈(天津科密歐科技有限公司);三氟乙酸(TFA)(美國(guó)Sigma公司);合成的32肽、21肽粗品由西安美聯(lián)公司提供。其氨基酸序列如下所示:32肽:NH2-Glu-Gly-Ile-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Pro-Thr-Gly-Leu-Arg-Gln-Ala-Cys-Gly-Gly-Ile-Glu-Gly-Pro-Arg-Thr-Leu-Gln-Ala-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-COOH;21肽:Trp-Pyr-His-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Trp-Ser-Leu-Tyr-D-Lys-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Arg-Cys-Pro-Gly-NH2。2.3色譜條件[0.2%]v/v/%將合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后,離心,保留上清液,棄去沉淀。取一定濃度的多肽樣品溶液進(jìn)樣至已用流動(dòng)相A液[水+0.1%TFA(V/V/%)]平衡過的RPLC色譜上,然后進(jìn)行線性梯度洗脫直至達(dá)到要求的B液濃度[乙腈+0.1%TFA(V/V/%)]。流動(dòng)相A、B液需超聲脫氣后使用。收集各色譜餾分進(jìn)行檢測(cè),再用100%B液洗脫10min,使殘余在柱上的物質(zhì)完全沖洗下來,然后再用相應(yīng)濃度的A液使柱平衡,以構(gòu)成一個(gè)完整的色譜過程。流速1.0mL/min,32肽的檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm,21肽為280nm。3結(jié)果與討論3.1色譜餾分的定性分析以乙腈作為流動(dòng)相,用RPLC對(duì)合成的32肽和21肽的粗品進(jìn)行分離。圖1和圖2分別是32肽和21肽的RPLC色譜分離圖。從圖1和圖2對(duì)兩種多肽的分離結(jié)果可看出,二者的組成都比較復(fù)雜。由于沒有32肽和21肽的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照,無法確認(rèn)32肽和21肽的目標(biāo)峰,因此必須收集主要的色譜餾分并對(duì)各色譜餾分進(jìn)行定性分析,以便確定目標(biāo)多肽色譜峰的位置。分別收集圖1和圖2所示的各色譜餾分,冷凍干燥處理后用飛行質(zhì)譜對(duì)各色譜餾分的分子量進(jìn)行測(cè)定(質(zhì)譜圖未給出)。結(jié)果表明圖1中的色譜峰3和圖2中色譜峰2的餾分的分子量分別與合成32肽和21肽的分子量完全吻合,表明圖1中的色譜峰3和圖2中的色譜峰2分別是32肽和21肽的目標(biāo)峰。3.2rlc對(duì)多媒體的制備3.2.1線性梯度條件的選擇從圖1和圖2可看出,32肽和21肽的組分都較復(fù)雜,需要選擇合適的色譜條件對(duì)其進(jìn)行最優(yōu)化分離,這樣才能用最少的分離步驟和最短的時(shí)間得到合格的產(chǎn)品。由于32肽與雜質(zhì)組分的性質(zhì)非常相似,雖然選擇不同的梯度方式,用RPLC對(duì)32肽的分離效果還是得不到改善。而從圖2可看出,只要選擇適當(dāng)?shù)纳V條件,就可使21肽的目標(biāo)峰(峰2)與雜質(zhì)峰得到分離,因此對(duì)其梯度方式進(jìn)行了選擇。我們選擇了6種線性梯度方式,并用RPLC對(duì)21肽進(jìn)行分離。除圖2給出的1種線性梯度方式外,圖3還給出了兩種線性梯度下,RPLC對(duì)21肽粗品的色譜分離圖。比較圖2和圖3可看出,采用圖3b所示的線性梯度方式,可對(duì)21肽進(jìn)行較好的分離。3.2.2肽和21肽的進(jìn)樣量對(duì)分離效果的影響由于沒有制備型的反相色譜柱,所以我們用分析型的反相色譜柱通過多次收集樣品組分制備多肽。只要在保證柱子對(duì)樣品的基本分離效果的前提下,盡可能多的進(jìn)樣,就可一次制備更多的樣品,從而縮短制備時(shí)間,故應(yīng)對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行選擇。32肽和21肽的進(jìn)樣量分別為1.0mg,2.5mg,3.0mg,3.5mg和5.0mg。當(dāng)進(jìn)樣量大于5.0mg時(shí),分離效果逐漸變差,因此,32肽和21肽制備時(shí)的進(jìn)樣量為5.0mg。通過多次分離純化,對(duì)32肽和21肽的目標(biāo)峰進(jìn)行了大量的收集,然后將所收集的樣品進(jìn)行凍干,除去水和有機(jī)溶劑。3.2.3肽的分離純化用RPLC對(duì)32肽和21肽凍干樣品的純度進(jìn)行分析檢測(cè),分離結(jié)果如圖4和圖5所示。從圖5的分析結(jié)果可看出,21肽的純度為98.6%,達(dá)到了產(chǎn)品純度95%的要求,因此,用上述方法用4天時(shí)間通過42次的分離純化共制備了高純度的21肽100mg。而圖4中32肽的純度只有80%左右,達(dá)不到95%的純度要求,因此需要對(duì)其進(jìn)行二次純化和制備。3.3肽的色譜分離32肽經(jīng)RPLC分離純化后,其純度僅有80%左右,還含有較多雜質(zhì),因此需對(duì)其進(jìn)行二次純化和制備。為了更好地分離純化32肽,必須對(duì)其分離條件再次進(jìn)行優(yōu)化。首先,對(duì)其分離梯度模式進(jìn)行選擇,分別選用了5種線性梯度,線性梯度模式分別為:(1)10%→60%B,30min線性;(b)20%→60%B,30min線性;(c)30%→60%B,30min線性;(d)20%→40%B,30min線性;(e)25%→35%B,30min線性。圖6給出了3種梯度模式下32肽的RPLC色譜分離圖。從圖6可看出,用梯度e可使32肽與雜質(zhì)進(jìn)行有效分離,因此選用梯度e對(duì)32肽進(jìn)行二次分離純化。當(dāng)32肽凍干樣品的進(jìn)樣量超過5.0mg時(shí),樣品的分離度大大