多肽和蛋白質(zhì)藥物的研究進(jìn)展

多肽和蛋白質(zhì)藥物的研究進(jìn)展

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并被用于臨床應(yīng)用。與化學(xué)藥物相比,多肽和蛋白質(zhì)藥物(peptideandproteindrugs,PPD)具有作用靶點(diǎn)專一、不良反應(yīng)少以及藥效作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),故在現(xiàn)代疾病的預(yù)防和治療中的應(yīng)用日益廣泛;但多肽和蛋白質(zhì)由于分子量大、結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜和理化性質(zhì)特殊,機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生了多種屏障,如酸屏障、酶屏障和膜屏障,限制了這類藥物的口服吸收。目前,上市的PPD常規(guī)給藥途徑多以注射為主。PPD口服給藥是一種方便且提高患者依從性的給藥方式,自20世紀(jì)90年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)這一領(lǐng)域的研究非?；钴S?？朔PD的口服給藥技術(shù)難題,將會(huì)給生物制藥工業(yè)帶來(lái)巨大變化并造福人類。本文從PPD口服的認(rèn)識(shí)過(guò)程、吸收機(jī)制、影響因素及提高策略等方面進(jìn)行了綜述。1ppd口服制劑隨著現(xiàn)代生物技術(shù)迅猛發(fā)展,多肽或蛋白質(zhì)不斷被開(kāi)發(fā)成藥品,以紅細(xì)胞生成素、干擾素和胰島素為代表的近百種PPD已經(jīng)在臨床應(yīng)用。1982年,世界第一個(gè)基因工程產(chǎn)品人胰島素上市;1992年,我國(guó)第一個(gè)基因工程產(chǎn)品干擾素α1b上市。但上述PPD在臨床上只有通過(guò)im,iv或sc給藥才能產(chǎn)生治療作用,藥物學(xué)家一直致力于PPD口服制劑研究。關(guān)于PPD口服吸收,過(guò)去人們一直認(rèn)為蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸道酶降解后以氨基酸形式被吸收,后來(lái)發(fā)現(xiàn)其消化產(chǎn)物主要是多肽如二肽和三肽等。20世紀(jì)90年代,對(duì)PPD口服吸收有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),PPD可通過(guò)液相或受體介導(dǎo)的胞飲作用方式吸收入血,對(duì)于12個(gè)以下氨基酸組成的多肽,實(shí)現(xiàn)口服給藥的可能性很大,而對(duì)于蛋白質(zhì),則難以預(yù)料。但是,多學(xué)科的合作為PPD口服制劑的成功開(kāi)發(fā)提供了機(jī)遇。進(jìn)入21世紀(jì),對(duì)PPD口服吸收機(jī)制又有了新的認(rèn)識(shí),發(fā)現(xiàn)一些多肽可通過(guò)腸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收入血,拓展了PPD吸收途徑。逐漸意識(shí)到要成功開(kāi)發(fā)PPD口服制劑,必須解決酶屏障和膜屏障兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,利用納米材料、脂質(zhì)體和酶抑制劑等技術(shù),完全可能在不久的將來(lái)攻克這一難題。2多孔藥物和蛋白質(zhì)藥物的口服吸收機(jī)制和方法2.1小鼠感染ppd的轉(zhuǎn)運(yùn)小分子藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)以簡(jiǎn)單擴(kuò)散為主,而PPD口服給藥經(jīng)過(guò)胃腸道主要依靠載體轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)通過(guò)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸黏膜內(nèi),如圖1所示,隨后PPD由淋巴回流進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。未被消化酶降解的多肽與腸表面膜基底外側(cè)的H+依賴型多肽載體結(jié)合,以H+梯度和膜電位差為動(dòng)力,經(jīng)多肽載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入基底膜內(nèi)側(cè),由于H+與多肽是共同通過(guò)上皮細(xì)胞膜的,這一系統(tǒng)又稱為H+-依賴型腸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。2.2ppd的胞飲作用當(dāng)PPD與小腸黏膜刷狀緣膜的受體結(jié)合后,結(jié)合部位膜內(nèi)陷并形成吞噬體而進(jìn)入小腸壁(圖2),可將40ku大小的完整蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),但有很少一部分PPD通過(guò)胞飲作用從血管外轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸上皮細(xì)胞內(nèi)。PPD通過(guò)胞飲作用進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞,最典型的例子就是通過(guò)M細(xì)胞途徑(圖3),M細(xì)胞是一種位于腸集合淋巴結(jié)上的微皺褶細(xì)胞,含有M細(xì)胞小囊和派伊爾淋巴集結(jié),M細(xì)胞表面能吸附顆粒,它可將完整的抗原蛋白或病毒分子經(jīng)胞吞、胞吐途徑吸收并呈遞給黏膜下免疫細(xì)胞。2.3藥物的濃度、電化學(xué)勢(shì)如圖4所示,PPD可以經(jīng)過(guò)細(xì)胞旁路被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),不需要消耗能量,依靠腸上皮細(xì)胞兩側(cè)的藥物濃度、電化學(xué)勢(shì)的差別形成的。阻礙PPD經(jīng)細(xì)胞旁路入血的是小腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接或閉合帶,但是,餐后在腸腔葡萄糖刺激下,腸黏膜細(xì)胞骨架收縮,緊密連接暫時(shí)開(kāi)放,某些相對(duì)分子質(zhì)量為0.9~1.9ku的PPD可經(jīng)此途徑吸收入血。3影響蛋白質(zhì)和養(yǎng)分口服的因素3.1般情況下的轉(zhuǎn)運(yùn)入血時(shí)間由于PPD相對(duì)分子質(zhì)量大,人的小腸黏膜細(xì)胞間隙為5nm,一般情況下難以透過(guò)小腸上皮以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式轉(zhuǎn)運(yùn)入血。小鼠的腸黏膜孔徑約0.4nm,氨基酸、二肽和三肽可以穿過(guò)腸壁,多肽和蛋白質(zhì)則難以通過(guò)。3.2硫鍵及其空間結(jié)構(gòu)影響PPD活性的因素主要是氨基酸序列、末端基團(tuán)、肽鏈和二硫鍵及其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)和多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)在體外穿過(guò)人結(jié)腸癌細(xì)胞的分子層中發(fā)揮了重要作用,這是由于蛋白質(zhì)的部分展開(kāi),使疏水部分暴露,可以穿過(guò)液態(tài)脂質(zhì)雙分子層。3.3載體生物利用度低蛋白質(zhì)是一種親水性高分子化合物,決定了它既不能通過(guò)細(xì)胞間隙簡(jiǎn)單擴(kuò)散,也難以與細(xì)胞膜融合,如果不借助載體則很難通過(guò)小腸黏膜入血,因此生物利用度較低。3.4障腸道含有消化酶(1)酸屏障由于大多數(shù)多肽和蛋白質(zhì)不耐酸,胃酸的pH值為1~3,當(dāng)PPD通過(guò)胃時(shí),一部分藥物被水解失去生物活性,而且整個(gè)腸道pH環(huán)境復(fù)雜多變,一些多肽還容易發(fā)生pH依賴性水解,這成為PPD口服吸收的第一道屏障難以逾越。(2)酶屏障胃腸道含有,如多種消化酶,主要包括:(1)腔道分泌的酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等;(2)刷狀緣分泌的酶,如羧肽酶、氨肽酶、肽鏈內(nèi)切酶和外切酶等,酶消化作用是導(dǎo)致PPD降解的主要原因,這是PPD口服吸收的第二道屏障。(3)膜屏障首先小腸的上皮細(xì)胞附著一層水合凝膠,稱為不流動(dòng)水層,其下方是磷脂表面活性層,疏水性強(qiáng),阻礙了PPD等親水性分子向上皮細(xì)胞的擴(kuò)散。其次,小腸上皮細(xì)胞膜的磷脂雙分子層具有半透膜性質(zhì),允許脂溶性藥物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),而PPD等大分子以及親水性藥物需要通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。最后,阻止PPD口服吸收的主要屏障是致密的腸上皮細(xì)胞膜,因?yàn)樾∧c細(xì)胞間隙僅為5nm,在不加任何促吸收劑的情況下,只有分子量小的藥物才能通過(guò)?？傊?小腸黏膜特殊的組成和結(jié)構(gòu)是PPD口服吸收的第三道屏障。3.5腸道刷狀緣、腸內(nèi)皮細(xì)胞溶酶體有些從胃腸道吸收入門靜脈系統(tǒng)的藥物進(jìn)入肝后被肝藥物代謝酶代謝,具有首過(guò)效應(yīng)。腸道的刷狀緣、腸內(nèi)皮細(xì)胞溶酶體同樣參與首過(guò)效應(yīng)。膽汁內(nèi)容物也有一定的作用,包括水解、氧化、脫烷基化和還原等。一部分藥物被這些酶代謝,從而使藥物進(jìn)入血液循環(huán)的有效量減少,故首過(guò)效應(yīng)是導(dǎo)致PPD口服生物利用度低的原因之一。4改善山羊和蛋白質(zhì)藥物口服吸收的策略4.1可逆酯化反應(yīng)通過(guò)對(duì)PPD進(jìn)行化學(xué)修飾形成前藥或衍生物,可以保護(hù)PPD免受蛋白酶等消化酶的降解作用,對(duì)PPD的結(jié)構(gòu)修飾一般要考慮親脂性、電荷數(shù)、等電點(diǎn)、化學(xué)穩(wěn)定性以及對(duì)載體的親和力等。例如,酯化反應(yīng)可將多肽或蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái),從而提高PPD的親脂性,但酯化反應(yīng)可能會(huì)降低PPD的生物活性,最近研發(fā)的一種可逆酯化反應(yīng)技術(shù)可保證酯化的PPD經(jīng)口服后再生恢復(fù)其生物活性,已有幾種PPD經(jīng)過(guò)這種技術(shù)改造后,提高其在胃腸道的吸收程度、穩(wěn)定性及生物活性。聚乙二醇共軛修飾不僅提高PPD脂溶性并且有防止酶解的作用。美國(guó)Nobex公司通過(guò)親水性聚乙二醇鏈和親脂性烷基鏈在賴氨酸-29位點(diǎn)上對(duì)人重組胰島素進(jìn)行共價(jià)修飾,臨床試驗(yàn)證明可以治療1型和2型糖尿病,生物利用度為5%。4.2干擾膜的生物活性吸收促進(jìn)劑是一類可逆性增強(qiáng)藥物胃腸道透過(guò)性的小分子化合物,是提高生物膜通透性的主要方法。吸收促進(jìn)劑可以非特異性地暫時(shí)打破小腸屏障、改變細(xì)胞緊密連接的完整性及擴(kuò)大細(xì)胞間隙,或者通過(guò)干擾膜磷脂雙分子層穩(wěn)定性使其形成小孔,從而提高生物膜通透性,增強(qiáng)PPD等藥物經(jīng)胃腸道吸收入血。傳統(tǒng)的吸收促進(jìn)劑如膽酸鹽類、表面活性劑、水楊酸類、氨基酸類衍生物和金屬螯合劑等長(zhǎng)期使用后具有一定的不良反應(yīng),制約其應(yīng)用。近年研制的一些不良反應(yīng)小的新型吸收促進(jìn)劑,如細(xì)胞膜穿透肽,可以介導(dǎo)藥物分子跨膜進(jìn)入不同組織和細(xì)胞,其富含堿性氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)穿膜起著重要作用,日本學(xué)者研制基于精氨酸殘基組成的細(xì)胞膜穿透肽促進(jìn)了胰島素經(jīng)鼻黏膜、口服給藥的吸收。Petrus等用維生素B12與胰島素制成納米粒,有效地促進(jìn)胰島素口服吸收。4.3a-2-甲基苯甲酰胺的合成酶抑制劑能夠有效地防止酶對(duì)PPD的降解,研究表明PPD與酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后,其口服生物利用度顯著提高。酶抑制劑可分為4類:(1)非氨基酸類P-氨基苯甲酰胺、1,2,3,4-四氫-1-萘甲酸4-(4-異丙基-1-哌啶羥基)-苯酯甲烷磺醋(FK-448)和甲磺酸卡莫司他(camostatmesylate);(2)氨基酸類肽類和修飾肽;(3)胰凝乳蛋白酶抑制劑、氨肽酶抑制劑、桿菌肽和鎮(zhèn)痛素;(4)肽酶抑制劑抑肽酶和胰蛋白酶抑制劑。應(yīng)用包曼-伯克抑制劑和彈性蛋白酶抑制劑制備殼聚糖降鈣素口服制劑,可以降低其在胃腸道內(nèi)的降解。4.4腸道納米粒粒徑的確定納米粒是直徑在10~100nm的超微小藥物載體,可通過(guò)細(xì)胞旁路或腸黏膜派伊爾淋巴集結(jié)的M細(xì)胞吞噬途徑吸收入血,納米粒包裹PPD可以避免胃腸道分泌的酸和消化酶的破壞,載體納米粒粒徑越小,越易吸收,且具有一定靶向性。制備納米粒的載體材料可分為兩種類型:生物降解型和非生物降解型。有機(jī)體內(nèi)的水解酶可以將生物降解聚合物材料水解成水和二氧化碳,近年來(lái)對(duì)生物降解聚合物材料的研究更為重視,常見(jiàn)的生物降解型納米材料有交鏈聚酯、聚原酸酯、聚酐和多肽等。以研究胰島素口服制劑等為代表的載體納米微粒見(jiàn)表1,其中殼聚糖納米粒在開(kāi)發(fā)口服胰島素用于治療糖尿病取得了一定的成效。4.5降血糖作用的藥物脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜雙層脂膜結(jié)構(gòu)類似,可通過(guò)腸黏膜細(xì)胞的吸附、脂質(zhì)交換、融合和內(nèi)吞等作用機(jī)制,增強(qiáng)細(xì)胞攝取藥物,特別是促進(jìn)了派伊爾淋巴集結(jié)對(duì)藥物的攝取。而且,脂質(zhì)體保護(hù)PPD等藥物免受胃腸道酶的降解,起到緩釋作用,延長(zhǎng)半衰期。Kv等等制備沙雷菌肽酶(serrationpeptidase)脂質(zhì)體并以Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)體劑型比原藥有更好的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效果。Hanato等制備的胰高血糖素樣多肽脂質(zhì)體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有良好的降血糖作用。但是,脂質(zhì)體用于PPD載體存在兩個(gè)問(wèn)題:(1)脂質(zhì)體在制備過(guò)程中,PPD的包封率較低;(2)脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性,因?yàn)槲改c道存在的膽鹽會(huì)破壞脂質(zhì)體的雙分子層結(jié)構(gòu),使脂質(zhì)流失,導(dǎo)致脂質(zhì)體的穩(wěn)定性比較差。4.6乳化油制劑乳劑中的油相可增加PPD的膜通透性、也可能增加藥物的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn),從而提高生物利用度。早在1997年Cortecs公司就開(kāi)發(fā)了胰島素油制劑,通過(guò)兩親性表面活性劑的作用,將親水性藥物如胰島素、降鈣素等增溶至弱極性的油中形成澄清透明的溶液,6例健康志愿者口服該制劑后血糖降低34%。國(guó)外已有環(huán)孢素微乳軟膠囊上市,國(guó)內(nèi)也將胰島素制成復(fù)乳,ig給予小鼠后有顯著降血糖作用,北京大學(xué)研制的蚓激酶油包水口服微乳具有較好的可行性。4.7ppd面包的制備胃腸道存在PPD特異性吸收的位點(diǎn),如果使PPD在此釋放,可避免各種消化酶的降解作用,最大程度地提高PPD的口服吸收,一般從結(jié)腸和小腸考慮定位釋藥。PPD吸收的最佳部位可能是大腸,因?yàn)樗幬镌诖送Ａ?0~30h,而且消化酶的活性較低。研究較多的是結(jié)腸定位釋藥,它具有延長(zhǎng)藥物的滯留時(shí)間、降低酶活性和增強(qiáng)吸收促進(jìn)劑的作用等優(yōu)勢(shì),常用α-淀粉、果膠鈣、殼聚糖、海藻酸、丙烯酸酯偶氮苯水凝膠以及果膠/半乳甘露聚糖等作為包衣材料。小腸的某些區(qū)域存在著與免疫有關(guān)的特定組織區(qū)域,如派伊爾淋巴集結(jié)能使淋巴因子和一些顆粒進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),使用腸溶衣或其他控釋技術(shù)使藥物在小腸釋放,可能增加PPD的吸收。4.8對(duì)家蠶生物反應(yīng)器的預(yù)測(cè)和治療Page等認(rèn)為基因工程在PPD口服制劑開(kāi)發(fā)方面具有很大潛力,口服基因藥物遞送載體包括病毒載體和合成高分子載體等,如霍亂毒素B亞單位對(duì)GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(細(xì)胞膜糖脂類受體)有高度親和力,當(dāng)霍亂毒素B亞單位連接到包裹抗原的脂質(zhì)體表面時(shí),小鼠口服給藥后,可顯著升高黏膜免疫球蛋白A和免疫球蛋白G水平。有人將熱休克蛋白A和霍亂弧菌封閉小帶毒素兩個(gè)基因進(jìn)行融合,并在大腸桿菌中高效表達(dá),研制成幽門螺桿菌熱休克蛋白A-霍亂弧菌封閉小帶毒素融合蛋白質(zhì)口服疫苗。本實(shí)驗(yàn)室采用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PPD口服給藥做了系列研究,利用基因工程改造功能基因并在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)一些用于口服的重組蛋白如霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、重組人乳鐵蛋白、重組人生長(zhǎng)激素、重組人破骨細(xì)胞形成抑制因子和口服基因工程疫苗等。Gong等構(gòu)建霍亂毒素B亞單位人胰島素融合基因,利用家蠶桿狀病毒高效表達(dá)霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素融合蛋白,ig給予非肥胖型糖尿病小鼠后抑制了胰島炎癥和糖尿病病理癥狀的發(fā)生;Meng等在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)里成功表達(dá)了霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素-綠色熒光蛋白融合蛋白,對(duì)該融合蛋白經(jīng)小腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程進(jìn)行追蹤,發(fā)現(xiàn)其ig給予10周齡的非肥胖型糖尿病小鼠后,產(chǎn)生了特異性抗體,并且誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的產(chǎn)生,延緩1型糖尿病的發(fā)作,改善其癥狀。目前,這項(xiàng)利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的胰島素口服制劑是一種治療1型糖尿病的新型藥物,現(xiàn)處于中試階段。家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子,ig給予小鼠、Beagle犬和獼猴后,具有升高白細(xì)胞作用;健康志愿者口服后其生物利用度平均為1%,現(xiàn)處于Ⅱ期臨床研究階段。Liu等在家蠶細(xì)胞中表達(dá)重組人乳鐵蛋白,表達(dá)量約為13.5mg·L-1,小鼠ig給藥后,可有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎癥狀。5ppd口服制劑自從1982年世界第一個(gè)基因工程產(chǎn)品人胰島素問(wèn)世以來(lái),大量的PPD就被開(kāi)