生物基質(zhì)中多肽類(lèi)藥物的定量檢測(cè)方法

生物基質(zhì)中多肽類(lèi)藥物的定量檢測(cè)方法

文獻(xiàn)號(hào)：1009-2501（2008）11-1309-06。近幾年來(lái),生物技術(shù)藥物發(fā)展迅速,某種程度上已成為主流治療藥物,占據(jù)了全球臨床前與臨床研究的一大部分。由于該類(lèi)藥物小劑量即有很強(qiáng)的藥理作用,體內(nèi)濃度很低,結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性物質(zhì)非常接近或相同,因此,藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)比較復(fù)雜,如何專(zhuān)一地識(shí)別目標(biāo)生物技術(shù)藥物而不受其代謝物及其他物質(zhì)的影響,一直是該類(lèi)藥物體內(nèi)分析的主要難點(diǎn),也是生物技術(shù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究和研發(fā)的主要瓶頸之一,多肽類(lèi)藥物也不例外。目前,多肽藥物測(cè)定方法的研究主要集中在如何提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)特異性上。小分子藥物的體內(nèi)分析方法通常不適用于多肽類(lèi)藥物體內(nèi)分析。通常多肽類(lèi)藥物的體內(nèi)分析方法有生物檢定法、同位素示蹤技術(shù)、免疫法和質(zhì)譜法。1測(cè)定動(dòng)物細(xì)胞的鑒定主要用于生物制品純度、穩(wěn)定性和效價(jià)的測(cè)定。它可以定義為以功能性的特異生物應(yīng)答為基礎(chǔ)的測(cè)定待測(cè)物質(zhì)生物活性的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)生物檢定法包括體內(nèi)測(cè)定和體外測(cè)定。體內(nèi)檢定法即給予動(dòng)物生物技術(shù)藥物后測(cè)定動(dòng)物對(duì)藥物的響應(yīng)。該方法的缺點(diǎn)在于相對(duì)高的資金投入、低專(zhuān)屬性、動(dòng)物間的高變異以及顯著的時(shí)間特異性。體外生物檢定法是基于受試藥物對(duì)細(xì)胞的刺激后產(chǎn)生的可測(cè)量的細(xì)胞應(yīng)答,此方法相對(duì)于體內(nèi)生物檢定法具有低的檢測(cè)變異。盡管與體內(nèi)測(cè)定相比,體外測(cè)定有很多優(yōu)勢(shì),但其又有很多影響因素,如活性代謝物、生物基質(zhì)、環(huán)境因素等。此外,體外測(cè)定方法只是生物活性的替代測(cè)定,并不代表體內(nèi)發(fā)生的實(shí)際情況。2elisa法由于免疫學(xué)方法的高靈敏度、高精密度、高選擇性和相對(duì)簡(jiǎn)單的操作,免疫法已成為定量生物樣品中多肽類(lèi)藥物的常用技術(shù)。免疫法包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)、單克隆抗體放射免疫法(RIA)等。由于其他測(cè)定方法的局限性,ELISA仍是定量生物技術(shù)藥物的標(biāo)準(zhǔn)方法,包括各種人類(lèi)細(xì)胞因子、阿替普酶及替奈普酶之類(lèi)的生物工程組織型纖溶酶原激活劑、嵌合單克隆抗體、紅細(xì)胞生成素-α等。如AlciatoF等使用ELISA方法測(cè)定人血漿中生長(zhǎng)阻滯蛋白6的濃度,KoboriH等使用ELISA方法分別測(cè)定大鼠和小鼠血漿及尿中血管緊張素濃度。ELISA方法盡管應(yīng)用廣泛,但仍有其局限性,特異抗體對(duì)多肽活性和非活性形式及代謝結(jié)構(gòu)缺乏專(zhuān)屬性,即物質(zhì)只要有抗原位點(diǎn)存在就可發(fā)生酶聯(lián)反應(yīng),非特異性的表面抗原位點(diǎn)識(shí)別可使測(cè)定濃度高于實(shí)際濃度,天然抗體也可與藥物同時(shí)檢出,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因而,不同試劑盒之間也沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。放射免疫法是將放射性原子標(biāo)記在氨基酸上,分為125I標(biāo)記的外標(biāo)法和3H、14C、35S標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)法。125I標(biāo)記藥物主要用于受體結(jié)合和代謝途徑研究。以替耐普酶為例,放射性標(biāo)記給藥后,通過(guò)放射性自顯影技術(shù)很好地說(shuō)明了替耐普酶主要經(jīng)肝代謝清除。問(wèn)題是標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)碘原子可能會(huì)改變藥物的藥代性質(zhì),碘標(biāo)記藥物給藥后可能發(fā)生脫鹵化,造成試驗(yàn)結(jié)果誤差。對(duì)于放射性原子內(nèi)標(biāo)法,標(biāo)記的藥物在其代謝過(guò)程中會(huì)釋放含標(biāo)記原子的氨基酸,該氨基酸會(huì)參與內(nèi)源性蛋白質(zhì)的合成。由14C標(biāo)記rhIL-2兩條不同的藥代曲線可以推論出14C-rhIL-2代謝后為氨基酸,該氨基酸參與內(nèi)源性蛋白質(zhì)合成循環(huán)。3同步跟蹤技術(shù)il3.1標(biāo)記和未標(biāo)記同位素的藥物和檢測(cè)穩(wěn)定同位素?zé)o放射性,物理性質(zhì)穩(wěn)定,以一定比例存在于自然界,可在合成過(guò)程中引入藥物分子,從而得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記的藥物,再通過(guò)GC-MS或LC-MS方法進(jìn)行測(cè)定。藥物研究中常用的穩(wěn)定同位素有2H,13C,15N和18O等。近年來(lái),SIL方法已成功用于藥物的吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化、排泄、相互作用及立體選擇性等研究。人體主要是由碳、氫、氧、氮元素組成的,研究結(jié)果表明,僅在體內(nèi)有高含量的2H時(shí)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生顯著毒性,給予大量的13C和18O均不會(huì)出現(xiàn)生理毒性,人體所含的及每天攝入的穩(wěn)定同位素含量遠(yuǎn)大于標(biāo)記的試驗(yàn)藥物給予量,因而SIL藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物或人沒(méi)有影響,是安全可行的。因此,此方法在臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究方面具有很大優(yōu)勢(shì)。但是同位素效應(yīng)可能使藥物的代謝特征和生理特征發(fā)生改變。同位素效應(yīng):由于重同位素與輕同位素質(zhì)量不同,重同位素形成的鍵要比輕同位素的鍵能大,化學(xué)反應(yīng)中,打開(kāi)這類(lèi)化學(xué)鍵就成為限速步驟,重同位素的速度較輕同位素慢,這就是代謝同位素效應(yīng)。由于氘的質(zhì)量是氫的2倍,這個(gè)效應(yīng)很明顯,而對(duì)于碳、氮、氧之類(lèi)重同位素與輕同位素質(zhì)量差相對(duì)小的元素,代謝同位素效應(yīng)很小,甚至檢測(cè)不到。重同位素相對(duì)較強(qiáng)的鍵還可以改變藥物分子的很多特性,如質(zhì)譜裂解方式、極性、分子體積、范德華力、蛋白結(jié)合率等?？梢酝瑫r(shí)給予標(biāo)記和未標(biāo)記同位素的藥物,同時(shí)測(cè)定兩種形式的藥代參數(shù)以考察同位素效應(yīng),前提是需要事先建立特異準(zhǔn)確靈敏的測(cè)定方法。注意,當(dāng)使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測(cè)時(shí),[M+1]+荷質(zhì)比檢測(cè)標(biāo)記藥物時(shí)會(huì)受到未標(biāo)記藥物天然豐度的影響。避免同位素峰族干擾的最好方法是標(biāo)記三個(gè)以上的原子,使標(biāo)記藥物的質(zhì)量差≥3,此時(shí)同位素峰干擾會(huì)很小或不存在。另一個(gè)問(wèn)題是用何種同位素標(biāo)記和標(biāo)記位置問(wèn)題,主要取決于藥物結(jié)構(gòu)特征和體內(nèi)代謝特征。所標(biāo)記的位置不能放在藥物代謝失活的位置或藥物作用功能基團(tuán)上。因此,應(yīng)用該技術(shù)之前必須對(duì)所研究藥物的體內(nèi)代謝特征及在MS上離子化方式等有所了解,對(duì)于體內(nèi)代謝特征未知的新藥而言,此方法的應(yīng)用很受限制。3.2大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)在生物技術(shù)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究中,放射性標(biāo)記法因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快捷而常常被采用。常規(guī)放射性同位素標(biāo)記3H、14C、35S等可以通過(guò)培養(yǎng)液中加入標(biāo)記的氨基酸經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞株或細(xì)菌表達(dá)而進(jìn)行生物技術(shù)藥物的內(nèi)部標(biāo)記。Cossum等還用S-半胱氨酸對(duì)人類(lèi)松弛激素(hRlx-2)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)記,以比較hRlx-2在孕大鼠和非孕大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。125I可通過(guò)氯胺T法或Iodogen法對(duì)生物技術(shù)藥物進(jìn)行直接標(biāo)記,其機(jī)制為通過(guò)碘化反應(yīng)將125I共價(jià)結(jié)合在多肽藥物的芳香氨基酸殘基,如酪氨酸殘基的苯環(huán)或組氨酸殘基的咪唑環(huán)上。125I標(biāo)記的樣品比放射性高,制備容易,半衰期較短,成為目前常用的多肽藥物標(biāo)記物。戴舒佳等應(yīng)用125I標(biāo)記虎紋毒素-1后給大鼠硬脊膜外和靜脈注射以研究其藥代動(dòng)力學(xué);趙寧等用碘標(biāo)法研究重組人腫瘤壞死因子在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布。由此可見(jiàn),對(duì)于研究基因工程產(chǎn)品在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布該方法具有其它方法不可比擬的優(yōu)越性。但該方法也存在一些問(wèn)題,如標(biāo)記后是否會(huì)引起藥物在生物體內(nèi)代謝的變化及標(biāo)記同位素的脫離、標(biāo)記氨基酸的生物再利用等問(wèn)題,另外,該方法不能應(yīng)用于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。大量資料表明藥理劑量的外源性標(biāo)記生物技術(shù)藥物注射后由于在體內(nèi)迅速降解或被機(jī)體重新利用,導(dǎo)致樣品的總放射性并不代表原形標(biāo)記物的濃度。因此,用總放射性表示藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程往往是不恰當(dāng)?shù)?。所以生物技術(shù)藥物藥代動(dòng)力學(xué)特征的描述不能僅僅依賴于放射性標(biāo)記法的研究結(jié)果,還應(yīng)該結(jié)合其它分析方法進(jìn)行綜合分析。4主要的研究特點(diǎn)近年來(lái),人們關(guān)注更多的是LC-MS/MS,LC-MS/MS集高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、高專(zhuān)屬性的優(yōu)點(diǎn)于一體,因其對(duì)多數(shù)藥物結(jié)構(gòu)的通用性、檢測(cè)的專(zhuān)屬性和靈敏度等各方面的優(yōu)勢(shì),已迅速成為藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究中采用的主要分析方法。應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行研究具有如下特點(diǎn):⑴從根本上解決了色譜流出物的定性問(wèn)題;⑵獲得復(fù)雜基質(zhì)中單一成分的質(zhì)譜圖,有利于藥物、藥物代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的分離與鑒定;⑶具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的專(zhuān)屬性,不需要使分析物之間實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離,使得樣品預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)化,同時(shí)分析測(cè)試時(shí)間大為縮短;⑷具有多窗口檢測(cè)功能,允許同時(shí)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定性、定量分析。目前,LC-MS/MS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于肽類(lèi)分析。這一技術(shù)除與免疫學(xué)方法一樣具有高靈敏度外,還具有免疫學(xué)方法沒(méi)有的高選擇性。例如,強(qiáng)啡肽A1-13是一個(gè)有阿片樣作用的有五個(gè)代謝產(chǎn)物的多肽,研究人員使用MALID離子源的LC-MS技術(shù)對(duì)原型藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離,再結(jié)合酶抑制試驗(yàn)研究其復(fù)雜的代謝。隨著離子光學(xué)理論的發(fā)展,質(zhì)譜儀不斷改進(jìn),出現(xiàn)了多種離子源和質(zhì)量分析器。但由于多肽藥物氨基酸種類(lèi)不同、氨基酸排列順序不同、肽鏈的長(zhǎng)短不同、空間結(jié)構(gòu)不同等因素,使得離子源和質(zhì)量分析器中只有一部分適用于多肽分析。下面就主要對(duì)用于多肽定量測(cè)定的離子源和質(zhì)量分析器進(jìn)行闡述。4.1電噴霧放電技術(shù)的選擇離子源是質(zhì)譜的重要組成部分,功能是使待分析物的分子轉(zhuǎn)化為離子,有些離子源還具有把離子會(huì)聚成具有一定幾何形狀(矩形或圓形)和一定能量的離子束的作用。大氣壓電離(atmosphericpressureionization,API):API主要包括電噴霧(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)兩種模式。樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室完成,離子化效率高,大大增強(qiáng)了分析的靈敏度、穩(wěn)定性,是目前最軟的離子化技術(shù)。API的出現(xiàn)解決了LC-MS聯(lián)用技術(shù)中液相流速與質(zhì)譜儀在真空下工作的匹配問(wèn)題。ESI:該離子源主要適用于離子性、極性化合物,它能夠產(chǎn)生帶有多個(gè)電荷的陽(yáng)離子或陰離子而不是碎片離子,從而大大降低質(zhì)荷比,使質(zhì)荷比(m/z)降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍,極大地?cái)U(kuò)展了分子量的分析范圍,離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出,低化學(xué)噪音,容易獲得碎片離子信息,利于進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè),它還可以方便地與多種質(zhì)量分析器聯(lián)合使用。以上優(yōu)點(diǎn)對(duì)于極性較大、相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)于化學(xué)藥物較大的多肽藥物來(lái)說(shuō)是非常有利的。但結(jié)合多肽藥物自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),電噴霧電離在多肽的定量測(cè)定方面又有其局限性:有些多肽含較多非極性氨基酸,使得電離困難;多肽含有氨基酸的數(shù)量相差很多,造成各種多肽的空間結(jié)構(gòu)相差很大:氨基酸數(shù)目少、鏈短、空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,有的甚至就是一條直鏈,極性基團(tuán)不被遮蔽,容易形成離子,反之,極性基團(tuán)帶電的幾率大大降低;再者,如果極性基團(tuán)相距較遠(yuǎn),信號(hào)強(qiáng)度分散程度大,靈敏度降低較多,在ESI源情況下,多肽藥物通常帶多電荷,也分散了信號(hào)強(qiáng)度,降低了靈敏度。APCI:該電離為分子-離子反應(yīng)。其突出優(yōu)點(diǎn)為:APCI是最軟的電離方式之一,只產(chǎn)生單電荷峰,適合于分析相對(duì)分子質(zhì)量略小或極性較小的化合物,電離效率高;采用氣動(dòng)霧化,可滿足0.2～2.0mL/min的流速,能直接與常規(guī)柱連接;與ESI相比,APCI對(duì)溶劑選擇、流速和添加物的依賴性較小;當(dāng)樣品為非酸堿性物質(zhì),且易被蒸發(fā),或溶劑、流速、添加物不適合于ESI,或樣品有較差的ESI響應(yīng)時(shí),應(yīng)選用APCI法。其缺點(diǎn)在于:因?yàn)锳PCI是氣態(tài)離子化過(guò)程,要求待分析物有較好的熱穩(wěn)定性,但是多肽在高溫條件下其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變,發(fā)生例如脫水、斷鏈、空間結(jié)構(gòu)改變等現(xiàn)象,大大降低離子化效率,而且只有一部分極性較小的肽類(lèi)可與等離子體發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移生成分子離子。因此,APCI源的適用范圍要比ESI源小得多,一般情況下只有在ESI源不能很好離子化時(shí)才選用APCI源。冷噴霧離子化(cold-sprayionization,CSI):冷噴霧離子化是近年來(lái)新興的離子化技術(shù),該技術(shù)對(duì)ESI和APCI兩種電離方式的不足做了改進(jìn)。CSI在低溫下(-80～10℃)操作,可用于精確表征不穩(wěn)定的以非共價(jià)鍵作用的有機(jī)物種、不穩(wěn)定的反應(yīng)物、中間產(chǎn)物、非對(duì)稱(chēng)催化劑、超分子及初級(jí)生物分子;尤其用來(lái)表征用傳統(tǒng)質(zhì)譜離子化技術(shù)(如:ESI、APCI、MALDI)難以揍效的不穩(wěn)定非共價(jià)復(fù)合物。在分析多肽類(lèi)藥物,尤其是生物基質(zhì)多肽類(lèi)藥物樣本時(shí)冷噴霧離子化能最大限度地保證藥物在分析過(guò)程中不發(fā)生一級(jí)結(jié)構(gòu)上的變化,甚至是空間結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)也可最大限度地保證生物基質(zhì)樣本中內(nèi)源性蛋白多肽不會(huì)在源內(nèi)裂解,產(chǎn)生干擾碎片離子。由于該技術(shù)是近年才興起,因此還沒(méi)有其在多肽藥物定量檢測(cè)方面的文獻(xiàn)報(bào)道?；|(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI):此電離方式獲得的準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng),幾乎無(wú)碎片離子,因此可直接離子化多肽混合物;而且對(duì)樣品中雜質(zhì)的耐受量較大,因此生物樣品無(wú)需前處理或只做簡(jiǎn)單處理即可進(jìn)行分析;多肽樣品中往往含有鹽分,當(dāng)鹽含量在基質(zhì)的5%以下時(shí),不會(huì)影響多肽電離,可以省去脫鹽步驟,縮短分析時(shí)間。MALDI源在多肽定量方面的應(yīng)用,目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道,但已經(jīng)有儀器分析公司推出了一款MALDI-Q-TRAP型質(zhì)譜儀,渴望推動(dòng)多肽定量的進(jìn)一步發(fā)展。由上可見(jiàn),電噴霧離子化技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍,使得在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上準(zhǔn)確地分析相對(duì)高分子量的多肽藥物分子成為可能。4.2質(zhì)分析器的選擇質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀器的核心,是它將離子源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)荷比(m/z,m:離子的質(zhì)量數(shù),z:離子攜帶的電荷數(shù))的不同,在空間的位置、時(shí)間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進(jìn)行分離,以便得到按質(zhì)荷比(m/z)大小順序排列而成的質(zhì)譜圖。目前,用于多肽藥物定量分析的質(zhì)量分析器主要有以下幾種。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器:隨著大氣壓電離技術(shù)的出現(xiàn)及飛行時(shí)間質(zhì)譜儀功能的逐漸完善,利用精確質(zhì)量數(shù)對(duì)代謝物進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)構(gòu)表征重新引起藥物分析工作者的重視。目前市售的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀無(wú)論在掃描速度、靈敏度及分辨率方面都優(yōu)于四極桿質(zhì)譜儀和離子阱質(zhì)譜儀。在保持分辨率5000～10000的情況下,飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)代謝物的專(zhuān)屬性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于離子阱質(zhì)譜儀和四極桿質(zhì)譜儀在單位質(zhì)量分辨情況下的專(zhuān)屬性。四級(jí)桿質(zhì)量分析器:除飛行時(shí)間質(zhì)譜儀具有高分辨能力以外,目前三重四極桿的分辨率也有所提高,分辨率可達(dá)到0.05質(zhì)量單位,并用于多肽類(lèi)藥物體內(nèi)定量測(cè)定。離子阱質(zhì)量分析器:由離子阱的工作原理可以知道,它可以進(jìn)行多級(jí)MS分析,它的MS-MS功能主要是多級(jí)子離子譜,利用計(jì)算機(jī)處理軟件,還可以提供母離子譜,中性丟失譜和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)譜。4.3質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)實(shí)際應(yīng)用中,各種質(zhì)量分析器經(jīng)常串聯(lián)起來(lái)使用,以增加質(zhì)譜儀的分辨率、準(zhǔn)確度、靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍和掃描方式等。下面介紹幾種主要的串聯(lián)方式。三重串聯(lián)四極桿:三重串聯(lián)四極桿測(cè)定分辨率的不斷提高,已成為定量測(cè)定的主要質(zhì)譜類(lèi)型。YangJZ等分別用高效液相-熒光檢測(cè)(LC-FLU)和LC-ESI-MS-MS方法定量測(cè)定大鼠血漿中阿片類(lèi)肽DADLE及其環(huán)狀前體藥的濃度,實(shí)驗(yàn)證明LC-ESI-MS-MS方法較LC-FLU方法具有更高的靈敏度和精密度,滿足實(shí)驗(yàn)要求,且可以進(jìn)行快速檢測(cè)。同時(shí),穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)目前主要應(yīng)用于LC-MS/MS測(cè)定時(shí)標(biāo)記待測(cè)藥物作為內(nèi)標(biāo),這一技術(shù)成為藥代動(dòng)力學(xué)研究中具有前景的重要技術(shù),如ChangaD等對(duì)HIV細(xì)胞膜轉(zhuǎn)染阻滯劑T-20及其代謝物在人血漿中濃度的測(cè)定。串聯(lián)四極桿/線性離子阱系統(tǒng):線性離子阱技術(shù)是新發(fā)展質(zhì)譜技術(shù),把傳統(tǒng)串