固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)菜籽蛋白肽菌種的篩選

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)菜籽蛋白肽菌種的篩選

蔡棉碗是生產(chǎn)蔡棉油的副產(chǎn)品，含有35%4%的粗蛋白素。這是重要的植物蛋白質(zhì)資源。菜籽蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸組成符合FAO/WHO推薦模式值。因菜籽粕中含有硫甙、芥子酸等抗?fàn)I養(yǎng)成分,使菜籽餅粕作為植物蛋白資源在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。長(zhǎng)期以來(lái),對(duì)食物蛋白進(jìn)行水解改性是食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),因?yàn)?菜籽蛋白水解成多肽或氨基酸后,具有更好的生物活性和加工特性。生物固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽的研究在我國(guó)已有報(bào)道,而固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)菜籽肽的研究甚少,如果能篩選到產(chǎn)蛋白酶,水解菜籽蛋白效果較好的微生物,用于菜籽粕發(fā)酵,將有可能成為生產(chǎn)菜籽肽的新途徑。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉、白地霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、米曲霉和枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株,菜籽粕為原料,對(duì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的不同菌種作用效果進(jìn)行了比較研究,篩選出用于固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的優(yōu)良菌種,為今后的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1蛋白、氨基酸Bacillus.subtilis10160等產(chǎn)蛋白酶菌種中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;菜籽粕:以canola菜籽為原料,通過(guò)浸提脫油制得,粗蛋白含量42.15%,換算系數(shù)為6.25,水分8.48%;牛血清白蛋白、細(xì)胞色素、鈷胺酰胺(VB12)、Gly-Gly-Tyr-ArgSigma公司;其他試劑均為分析純。1.2儀器和檢測(cè)儀器立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司;pHS-3C型精密數(shù)顯pH計(jì)、722N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器廠;GL-20B型高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;PQX型多段可編程培養(yǎng)箱寧波東南儀器有限公司;AKTA蛋白質(zhì)純化儀通用電氣公司。1.3方法1.3.1懸浮液的制備從種子培養(yǎng)基中(按菌種說(shuō)明書(shū)制備)取一定量的孢子和細(xì)胞于無(wú)菌水中,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。1.3.2培養(yǎng)菌種、時(shí)間把制備好的菌懸液接入已滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,使基質(zhì)含水量為55%(霉菌培養(yǎng)基)、65%(細(xì)菌、酵母培養(yǎng)基)。調(diào)培養(yǎng)箱溫度30℃,濕度90%,定時(shí)攪拌通氣,培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣測(cè)定。發(fā)酵培養(yǎng)基:菜籽粕10g,自然pH值。1.3.3離心汁ml發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì),加蒸餾水定容至200ml,攪拌30min,2~4℃下5000×g離心15min;用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾上清液,除去不溶物和細(xì)菌,備用。1.3.4干草芽數(shù)測(cè)定血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定。1.3.5氮溶解指數(shù)的測(cè)定按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行測(cè)定。1.3.6測(cè)定氨基酸氮的條件按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行測(cè)定。1.3.7tca-2-雙縮哌-1-甲基-5-甲基苯磺酸酯tba-5-甲基苯磺酸酯zea法參照文獻(xiàn)所述方法,取一定量處理液,加入等體積10%的三氯乙酸(TCA),靜置30min,2~4℃下,5000×g離心15min,取2ml上清液,加8ml雙縮脲試劑,25℃下靜置30min,測(cè)OD540nm值。肽得率按公式(1)計(jì)算:1.3.8folin-酚法以酪蛋白(2%)為底物,按國(guó)標(biāo)SB/T10317-1999,采用Folin-酚法測(cè)定。40℃下,以每分鐘1ml酶溶液水解酪蛋白產(chǎn)生1μg的TCA可溶酪氨酸的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。1.3.9牛血清微量元素水平采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定。色譜條件:Superose1210/300GL(10×300mm)柱;流動(dòng)相50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0,0.15mmol/LNaCl;流速0.5ml/min;進(jìn)樣體積500μl;檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。分子量標(biāo)品為牛血清白蛋白(67000D)、細(xì)胞色素(12700D)、鈷胺酰胺(VB12,1355D)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451.48D)。處理液稀釋5倍后測(cè)量。1.4處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示;用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶實(shí)驗(yàn)室小試一般因3~5d效果較好;因此,本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了發(fā)酵3d和5d的相關(guān)數(shù)據(jù)。2.1蛋白質(zhì)水解對(duì)菜籽粕可溶性氮的影響由圖1可以看出,微生物發(fā)酵菜籽粕過(guò)程中,氮溶解指數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)都略有升高。原因是在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中,產(chǎn)生的蛋白酶將菜籽粕中不易溶于水的蛋白質(zhì)水解成易溶于水的多肽和氨基酸,相應(yīng)地,水溶性氮含量隨之上升。其中宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵效果比較明顯,氮溶解指數(shù)都超過(guò)了65%,黑曲霉、地衣芽孢桿菌和米曲霉次之,而白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵幾乎沒(méi)有促進(jìn)菜籽粕中的蛋白質(zhì)的溶解,氮溶解指數(shù)與原樣相比變化不大,原因可能是菜籽粕中存在不利于這幾種菌種生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的因子。2.2枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的變化圖2顯示了隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),氨基酸態(tài)氮的變化趨勢(shì)與氮溶解指數(shù)一致;但是,與霉菌發(fā)酵相比,枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的氨基酸態(tài)氮比較低,原因可能是霉菌產(chǎn)的蛋白酶類(lèi)大多是外切酶,水解過(guò)程中產(chǎn)生了較多的氨基酸,而芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶是內(nèi)切酶,把蛋白質(zhì)水解成小分子肽,暴露在外的氨基端相對(duì)較少。從不同菌種發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮的大小可以看出宇佐美曲霉、雅致放射毛霉較有利于發(fā)酵。2.3發(fā)酵肽得率的測(cè)定肽得率顯示發(fā)酵后處理液中低分子量菜籽蛋白肽含量的高低。圖3說(shuō)明不同菌種發(fā)酵菜籽粕后多肽得率的大小,可以看出,宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵的肽得率明顯高于其他菌種。肽得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化不大,雅致放射毛霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的菜籽肽得率隨時(shí)間延長(zhǎng)略有降低,可能是多肽在外切酶的作用下被進(jìn)一步水解成游離氨基酸的緣故。2.4產(chǎn)蛋白酶的酶活力對(duì)不同菌種發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的研究可以看出(圖4),發(fā)酵后米曲霉產(chǎn)蛋白酶的酶活力最大,發(fā)酵5d為3560U/ml,雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的酶活力相對(duì)較大。從以上指標(biāo)可以看出,米曲霉雖然產(chǎn)蛋白酶的酶活力較高,但該蛋白酶類(lèi)可能只是端切酶,水解蛋白產(chǎn)生了較多的氨基酸。2.5蛋白肽分子量的變化情況為了進(jìn)一步了解微生物發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)菜籽肽的具體水解機(jī)制,對(duì)上述分析結(jié)果中發(fā)酵效果較好的6個(gè)菌種發(fā)酵5d后的處理液,用凝膠過(guò)濾色譜研究蛋白肽分子量的變化情況,結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖中可以看出,黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉發(fā)酵后產(chǎn)生了較多的中高分子量的物質(zhì),宇佐美曲霉發(fā)酵液中紫外吸收較強(qiáng),產(chǎn)量較高;地衣芽孢桿菌、雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌的發(fā)酵則產(chǎn)生了較多的低分子量多肽,其中雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵后低分子量多肽產(chǎn)量較高,發(fā)酵效果較好。色譜法對(duì)發(fā)酵處理液中物質(zhì)的分子量分布分析結(jié)果與上述化學(xué)分析結(jié)果一致。3菜籽肽發(fā)酵菌種的篩選本研究利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)菜籽多肽,主要利用發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶及其酶解能力。上述分析結(jié)果可得出以下結(jié)論。黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母和地衣芽孢桿菌不利于在以菜籽粕為基質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和產(chǎn)酶,不能作為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的出發(fā)菌株。米曲霉固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)生了較多的可溶性氮,色譜分析結(jié)果表明產(chǎn)生了一種小分子量物質(zhì),且產(chǎn)量很高,蛋白酶酶活力也很高,但多肽得率卻較低,可以推測(cè)其發(fā)酵后產(chǎn)生蛋白酶可能是外切酶,作用于菜籽粕后生成了氨基酸,可作為某種特定氨基酸生產(chǎn)的選擇菌種。宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵效果