雞株病毒的分離鑒定

雞株病毒的分離鑒定

自1994年以來(lái)，江蘇、山東等地的雞群相繼流行一種以胰腺腫脹和腺體潰瘍?yōu)樘卣鞯膫魅静?。本病多發(fā)生于雛雞,主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)阻滯、羽毛生長(zhǎng)不良和消瘦;剖檢除較常見(jiàn)的腺胃炎變化外,尚可見(jiàn)胸腺、法氏囊萎縮,胰腺壞死。常因繼發(fā)感染而造成大批死亡。對(duì)本病的病原眾說(shuō)不一。王永坤等、王玉東等先后報(bào)道分離到冠狀病毒;Goodwin等對(duì)本病的病因進(jìn)行了綜述,認(rèn)為本病除由病毒引起外,有關(guān)的病因還有低纖維素日糧、生物源胺、真菌毒素等。為了找出該病發(fā)生的病因,我們采集發(fā)病雞的腺胃組織進(jìn)行了病毒的分離和鑒定。初步研究結(jié)果表明,發(fā)生于肉仔雞的,能從發(fā)病雞種雞胚中分離到呼腸孤病毒;發(fā)生于產(chǎn)蛋雞的,所分離到的病毒種類繁多,經(jīng)常能分離到冠狀病毒、新城疫病毒。但大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,本病的發(fā)生與冠狀病毒病、新城疫的流行特點(diǎn)相差甚遠(yuǎn)。我們還從發(fā)病雞腺胃組織中分離到1株網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒,并對(duì)該病毒能否引起傳染性腺胃炎作了研究。1材料和方法1.1分離人細(xì)胞取具有典型癥狀的發(fā)病雞,無(wú)菌采集雞血,加0.1%肝素抗凝。將抗凝全血經(jīng)4000r/min離心15min,小心吸取上層黃色血漿和白細(xì)胞層,繼續(xù)以2000r/min離心15min,棄上清,沉淀的白細(xì)胞用少量細(xì)胞培養(yǎng)液(MEM)懸浮,接種或置-20℃?zhèn)溆谩?.2凍融法制備pbs無(wú)菌采集發(fā)病雞腫脹的腺胃組織,用組織絞碎器碾碎,以含抗生素的PBS制成1∶5的勻漿,反復(fù)凍融3次,經(jīng)2500r/min離心25min,取上清用0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液接種或置-20℃?zhèn)溆谩?.3病毒的分離和鑒定1.3.1腺胃組織懸液的制備取10日齡SPF雞胚,按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。培養(yǎng)液用含5%小牛血清和含50%水解乳蛋白的MEM。將上述腺胃組織懸液,經(jīng)尿囊腔接種于9日齡SPF雞胚,置37℃繼續(xù)培養(yǎng)5~6d,連續(xù)盲傳3代。取第3代尿囊液接種于CEF,置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6d。1.3.2單克隆抗體檢測(cè)取接種病毒并培養(yǎng)6d的細(xì)胞,先用PBS(pH7.2)洗滌1次,然后用4℃預(yù)冷的冷丙酮固定5min。將雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的單克隆抗體(代號(hào)4058,由江蘇農(nóng)學(xué)院崔治中教授提供)作1∶1000稀釋,加入上述細(xì)胞中,37℃作用30min,用PBS(pH7.2)洗滌3次,用雙蒸水再洗滌1次,晾干后用兔抗鼠IgG熒光抗體(由本研究室提供)滴加到細(xì)胞上,置37℃作用30min后,先用雙蒸水洗滌1次,再用PBS洗滌3次,直接置熒光顯微鏡下鏡檢。設(shè)不接種病毒的正常細(xì)胞對(duì)照。1.3.3皮增生癥病毒抗體檢測(cè)用冷甲醇固定10min,用10%PBST封閉(37℃,1h)。將雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的單克隆抗體作1∶1000稀釋,加入上述細(xì)胞中,37℃作用1h,用PBS(pH7.2)洗滌3次,再加入兔抗鼠酶標(biāo)抗體(由本研究室提供),37℃作用1h,先用雙蒸水洗滌1次,再用PBS洗滌3次,加底物顯色。設(shè)細(xì)胞正常對(duì)照。1.4新城疫的免疫取白細(xì)胞接種于培養(yǎng)好的雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)6d,連續(xù)盲傳3代。取第3代細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶消化,按每只雞106個(gè)細(xì)胞的接種量,頸部皮下接種于1日齡健康雛雞20只。另以10只不作接種的同日齡雛雞作為對(duì)照組。同群飼養(yǎng),按常規(guī)方式飼養(yǎng)。分別于10日齡和60日齡進(jìn)行新城疫的免疫,于14日齡和28日齡進(jìn)行傳染性法氏囊病的免疫。每日觀察臨床表現(xiàn),死后進(jìn)行病理學(xué)檢查。1.5切割試驗(yàn)1.5.1腺體胃組織的薄切面檢查取發(fā)病雞腫脹的腺胃,用手術(shù)刀片切成1~2cm2小塊,2.5%戊二醛固定,按常規(guī)方法制備超薄切片,進(jìn)行電鏡檢查。1.5.2細(xì)胞毒性檢查取接種第3代細(xì)胞毒5d的CEF,傾去培養(yǎng)液,小心地用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,加入適量2.5%戊二醛,收集并低速離心成團(tuán),然后按常規(guī)方法制成超薄切片,電鏡檢查。2結(jié)果2.1疫、wsf-ld-4無(wú)菌采集發(fā)病雞血清10份,分別采用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)新城疫、傳染性支氣管炎抗體,新城疫血凝抑制價(jià)為21~4,傳染性支氣管炎血凝抑制價(jià)為0。采集10只發(fā)病雞的羽髓,按規(guī)程規(guī)定的方法作馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),結(jié)果均呈陰性。2.2細(xì)胞ifa和elisa試驗(yàn)發(fā)病雞腺胃組織病料接種于SPF雞胚,連續(xù)盲傳3代,雞胚不表現(xiàn)任何病理變化。將盲傳3代的尿囊液再經(jīng)CEF盲傳3代,細(xì)胞培養(yǎng)6d不表現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)。用發(fā)病雞白細(xì)胞接種于CEF,培養(yǎng)6d也不引起可見(jiàn)的CPE。但對(duì)在CEF上連續(xù)盲傳3代的細(xì)胞作IFA,以檢查是否有網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的存在,結(jié)果可在接種腺胃組織病料的細(xì)胞上觀察到強(qiáng)烈的免疫熒光反應(yīng),而未接種病料的細(xì)胞IFA呈陰性。同時(shí),進(jìn)行間接ELISA檢查,接種腺胃病料的細(xì)胞內(nèi)顯示強(qiáng)陽(yáng)性(OD460≥0.70),而未接種病料的CEF表現(xiàn)為陰性(OD460<0.20)。.說(shuō)明分別經(jīng)雞胚和CEF盲傳3代的CEF中存在網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒。2.3大量分布于細(xì)胞間的病毒顆粒在腺胃組織切片中可見(jiàn)大小在80~100nm、大量分布于細(xì)胞間隙的病毒顆粒;在細(xì)胞切片中可見(jiàn)大小為80~100nm的病毒顆粒,呈球形,有囊膜(圖1)。2.4剖檢及體重變化用第3代細(xì)胞培養(yǎng)物接種于1日齡雛雞,1個(gè)月后雞群生長(zhǎng)不良,精神不振,打盹,采食稍有減少,出現(xiàn)零星死亡。剖檢可見(jiàn)胸腺、法氏囊萎縮,腺胃輕度腫脹。而對(duì)照雞正常,無(wú)上述癥狀。2個(gè)月后,雞群生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻,平均體重僅為對(duì)照組的67.2%,死亡不斷增加。90日齡時(shí),攻毒雞群總死亡率在25%以上,剖檢病死雞可見(jiàn)腺胃極度腫大。3討論3.1雞表面概況及免疫抑制性雞傳染性腺胃炎的發(fā)生有規(guī)律可尋。臨床上能引起腺胃腫大的疾病有很多。這些疾病及其鑒別已有詳盡綜述。目前流行的雞傳染性腺胃炎主要表現(xiàn)以下2個(gè)特點(diǎn):(1)縱向傳播能力差,即發(fā)病雞一般來(lái)自同一雞場(chǎng)或同一種雞群;(2)是一個(gè)免疫抑制性疾病,主要表現(xiàn)為胸腺、法氏囊的萎縮。在眾多的疾病中,符合這種特點(diǎn)的疾病只能是網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥。3.2網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒分離鑒定根據(jù)以上分析結(jié)果,我們采用網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒單克隆抗體對(duì)腺胃組織分離物進(jìn)行了病原鑒定,結(jié)果證明,在分離物中存在網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒。分別用有病變的腺胃組織和不表現(xiàn)CPE的細(xì)胞作超薄切片,進(jìn)行電鏡檢查,也發(fā)現(xiàn)了網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的存在?；貧w試驗(yàn)證明,該病毒為本病的病原。事實(shí)上,由網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒引起的腺胃炎早在1987年就在我國(guó)的某些雞群中存在了。3.3雞馬立克氏病免疫后感染抗菌藥雖然早在1987年就證實(shí)了我國(guó)部分雞場(chǎng)中存在本病,但從來(lái)未像現(xiàn)在這樣引起大面積的流行。在回歸試驗(yàn)中,仿照馬立克氏病免疫接種的方法進(jìn)行攻毒試驗(yàn),復(fù)制出了與臨床癥狀完全相同的疾病。因此,目前我國(guó)流行的傳染性腺胃炎可能與馬立克氏病疫苗中污染了網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒有關(guān)。類似的情況在澳大利亞、日本等早有報(bào)道。3.4雞胚適應(yīng)毒種和分離后產(chǎn)生的病毒可能引起性狀的變化我們?cè)趯?duì)大量病例進(jìn)行病毒分離工作中,先后分離到冠狀病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒和一些直徑在20nm左右的小病毒顆粒。特別