脫毒芋莖尖培養(yǎng)及產量表現(xiàn)

脫毒芋莖尖培養(yǎng)及產量表現(xiàn)

植物病毒病是影響作物產量和品質的重要疾病之一。大多數(shù)植物都受到不同程度的病毒疾病的影響，尤其是營養(yǎng)繁殖的嚴重植物。芋(ColocasiaesculentaSchott)是世界各地廣為栽培的蔬菜和糧食作物。在我國芋栽培歷史悠久,優(yōu)良品種甚多,其中一些已成為出口創(chuàng)匯的拳頭產品,如福建福鼎芋、萊陽蜆河芋、廣西荔浦芋等。隨著改革開放和人民生活水平的提高,芋的市場需求大大增加,特別是沿海地區(qū)芋及其加工品出口量迅速增加,為芋頭生產的發(fā)展開拓了廣闊前景。但在長期利用球莖進行營養(yǎng)繁殖過程中,攜帶病毒的種芋直接將病毒傳給子代,并通過蚜蟲等介體在株間傳播,導致栽培芋已普遍受病毒侵染,造成品質劣變、產量降低。目前報道的芋病毒中分布最廣、危害最大的是芋花葉病毒(Dasheenmosaicvirus,DMV),感染這種病毒的植株的球莖大小、數(shù)目和品質都會明顯下降,產量損失接近60%。因此,采用組織培養(yǎng)技術對現(xiàn)有優(yōu)秀品種進行脫病毒研究很有必要。試驗對萊陽孤芋莖尖培養(yǎng)脫毒技術及脫毒后的產量變化進行研究,以便為芋脫毒技術的進一步應用奠定基礎。1材料和方法1.1tptp品種供試芋(ColocasiaesculentaSchott)品種為萊陽孤芋。將頂芽飽滿的球莖剝去外周鱗片,自來水沖洗后,切取0.5cm×0.5cm×1.0cm的帶頂芽芋塊進行表面滅菌,以獲得無菌外植體。1.2溫度和光照將經表面滅菌的帶芽小芋塊,在解剖鏡下剝取0.2～1.0mm大小的莖尖,接種于培養(yǎng)基上,置溫度白天(27±2)℃、夜間(20±2)℃、光照強度1500～2000lx、每天照光12h條件下培養(yǎng),注意觀察莖尖生長、分化情況。為了提高脫病毒效果,選剝離較小的莖尖(小于0.5mm)得到的試管苗再次剝取小于0.5mm的莖尖,于培養(yǎng)基中誘導芽分化,如此連續(xù)進行2次。1.3蛋白免疫活性測定病毒檢測在農業(yè)部植檢所進行,選經3次剝離莖尖培養(yǎng)獲得的試管苗為材料,采用酶聯(lián)免疫檢測和電鏡觀察兩種方法。酶聯(lián)檢測采用SPA-ELISA方法,芋花葉病毒抗血清購自美國Agdia公司。第1抗體及第2抗體的稀釋度為1/100和1/200。檢測樣品及陰性對照用抗原緩沖液稀釋成兩個濃度,即1/20和1/40,進行實際檢測。A蛋白酶標抗體購自上海生物制品研究所,工作濃度為1/40;反應結束后測定492nm下的OD值。電鏡觀察采用直接沾取和免疫誘捕法制備樣品在透射電鏡下觀察病毒形態(tài)。1.4種子栽植、脫毒對經病毒檢測證明已脫去病毒的株系進行組培快繁。當試管苗高3cm以上、生根3～5條時,開瓶煉苗1周后在溫室內進行移栽。成活后,待小苗具4～5片葉時即可出圃。每年春季將脫毒試管苗定植于網室,秋季得脫毒原原種芋;脫毒原原種芋在隔離條件下種植(1km內無天南星科植物種植),得脫毒原種芋。1.5種植篩選試驗2000和2001年將脫毒原原種芋、脫毒原種芋和對照(未脫毒)按隨機區(qū)組設計進行比較試驗,選擇脫毒芋和對照大小相近的球莖作種芋,小區(qū)面積24m2(長5m×寬4.8m),行距80cm、株距25cm,重復3次。收獲時每小區(qū)隨機選取18株作單株調查,單位面積產量以小區(qū)實際測產為準。2鹽藻葉片的分離和鑒定將剝取的莖尖轉接到適宜培養(yǎng)基上,5d后變綠并開始生長,說明已經成活。莖尖成活率與其大小有關,試驗表明,莖尖在不大于0.3mm時,較難成活;在大于0.6mm時,成活率達100%;在0.3～0.5mm時,成活率80%以上(表1)。成活的莖尖經40d的培養(yǎng),可分化形成不定芽,其分化率與培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑的配比及精胺(Spm)的濃度有關(表2)。對表2結果的進一步分析發(fā)現(xiàn),BA,NAA和Spm的最優(yōu)水平分別是1.0mg/L,0.2mg/L和20mg/L,即適宜于芋莖尖芽分化的最佳培養(yǎng)基為:MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Spm20mg/L。在該培養(yǎng)基上的進一步莖尖培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),其分化率均在98%以上。酶聯(lián)檢測的結果列于表3,其中S1-5為樣品,P、N分別代表陽性和陰性對照。表3數(shù)據(jù)顯示,陽性對照OD值大于健康植株陰性對照值兩倍以上,且不同處理的樣品檢測結果一致,說明處理方法對檢測結果影響不大,本次酶聯(lián)反應正確,試驗結果比較可靠。按照酶聯(lián)檢測的結果判斷原則,所測定樣品的OD值小于陽性對照值兩倍,因此,所測定的樣品與芋花葉病毒血清的抗原抗體反應被判為陰性。電鏡觀察的結果也顯示,在芋莖尖組培苗的所有測定樣品中,未見明晰的病毒粒體;而在對照樣品及陽性對照中,觀察到了不同的病毒粒體。由酶聯(lián)檢測和電鏡觀察結果可以證明經3次莖尖培養(yǎng)脫毒處理,這些芋組培苗脫毒效果比較理想,已成為脫毒苗。2.3脫病毒對生產對芋球莖的影響將已生根的試管苗取出,洗凈培養(yǎng)基后移栽于溫室苗床中,保溫保濕培養(yǎng)1周,試管苗即可恢復生長。1個月左右可長出4～5片葉,此時可出圃定植于防蚜網室內,當年秋季收獲的芋球莖即為脫毒原原種,脫毒原原種第2年種植所得芋球莖為脫毒原種。對脫毒芋和未脫毒芋(對照)后代球莖數(shù)量的統(tǒng)計結果表明,脫病毒后芋球莖數(shù)量明顯增加(表4)。其中,試管苗所形成的球莖數(shù)量最多,達每株31.2個,顯示出巨大的增產潛力;脫毒原原種、原種所形成球莖數(shù)量也達到每株24.8～27.6個,較對照高出37.0%～52.5%?？梢?脫病毒能顯著增加后代芋球莖的數(shù)量。脫病毒處理的主要作用之一是增加產量。通過對脫毒萊陽孤芋與對照的兩年田間試驗結果的比較發(fā)現(xiàn),脫病毒可使萊陽孤芋的單位面積產量較對照增加20.2%～43.9%(表5)。從表5可見,除脫毒試管苗的子芋重明顯較高外,脫毒原原種、原種的后代芋球莖中,子芋重和母芋重與對照差異不大,而孫芋重卻比對照增加51.8%～107.5%,因此,孫芋重的極顯著增加是脫毒芋增產的主要因素。此外,脫毒芋的商品芋產量也顯著高于對照,其中,脫毒原原種、原種的商品芋產量較對照增加49.9%～70.0%,明顯高于其單株總產的增加幅度(單株產量較對照增加28.4%～42.8%),說明脫病毒不僅能增加產量,還能提高大球莖的比例,從而大大提高其經濟價值。3對種病毒的檢測從本試驗的結果可見,脫毒芋試管苗直接栽培所結球莖較小、商品芋產量也較低(表4,5),但球莖數(shù)量多,從而使其產量較以球莖作種芋的未脫毒芋還提高9.2%。而脫毒原原種在球莖個數(shù)、商品芋數(shù)量和產量等指標上均較對照有極顯著增加,脫毒原種也有類似效果。但是脫毒芋的增產潛力可保持多少代、栽培上應怎樣充分發(fā)揮脫毒芋的增產潛力等問題還有待于進一步研究。另外,通過莖尖培養(yǎng)獲得的“脫毒苗”或“無毒苗”,只是通過鑒定不帶某種或某些病毒,事實上,植物常受到多種病毒的侵染,而且可能還帶有某些未知病毒,實際工作中不可能對所有病毒都進行檢測。本試驗也僅對嚴重影響芋頭生產、且侵染普遍的芋花葉病毒進行了檢測。而目前已鑒定的感染芋的病毒,除芋花葉病毒外,還有香蕉束頂病毒(bananabunchytopvirus),芋桿狀病毒(tarobacilliformvirus),芋瘦小病毒(colocasiabobonediseasevirus)和芋葉脈缺綠病毒(taroveinchlorosisvirus)等,因此,對我國芋主產區(qū)栽培芋進行全面的調查與檢測,明確我國芋感染病毒的種類及特點,建立無病毒種源供應體系,這不僅能使我國很多良種芋的寶貴資源得到保持和發(fā)展,還將對我國芋頭生產產生巨大的推動作用。2.1領導人的