十字花科植物不同器官的過氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

十字花科植物不同器官的過氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

花卉科的許多植物具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，通常用作食物和藥物。研究顯示,有些十字花科植物具有顯著的抗癌作用。過氧化物酶[peroxidase,POD,EC1.11.1.7],能有效地清除生物體內的過氧化物,是生物抗氧化保護系統(tǒng)的主要成分之一;苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶,藥用十字花科植物的許多藥用成分都由苯丙烷類代謝途徑產生;POD是一種多底物的酶,除過氧化氫作為其必須底物外,苯丙烷類代謝途徑所產生的許多產物也是POD的底物,POD,PAL在植物次生代謝中起重要作用。α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase,EC3.2.1.1)所產生的葡萄糖可為PAL和POD的代謝提供直接的或間接的碳骨架和氫供體。本研究選用開花時間都比較接近,且既可以食用又可以藥用的3種十字花科植物薺菜[Capsellabursa-pastoris(L.)Medic]、獨行菜(LepidiumapetalumWilld)和播娘蒿(Descurainiasophia(L.)Webb)作為材料,比較了在正常生理環(huán)境下3種植物花期不同器官的PAL,POD,α-淀粉酶的活性和可溶性蛋白、H2O2的含量,旨在探討它們之間的相互作用及其與藥用成分之間的關系,為提高十字花科植物的營養(yǎng)價值和藥用價值提供新的依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面十字花科植物薺菜、獨行菜、播娘蒿,分別于2004～2006年4月16～26日采自河南師范大學生物園。1.2方法1.2.1pal和pod的測定分別取植物的根、莖、葉、花,清洗干凈后,用濾紙蘸干,稱取2g,加適量的石英砂在冰浴下充分研磨,然后按M∶V=1∶1(根為1∶2)加入樣品緩沖液,其中POD的樣品緩沖液為pH7.0,50mmol/L磷酸緩沖液;α-淀粉酶為pH5.0,10mmol/L醋酸緩沖液;PAL為pH8.8,5mmol/L巰基乙醇,0.1mol/L硼酸緩沖液;H2O2樣品則在加入0.5mL蒸餾水和3mL丙酮勻漿后,加入同體積的萃取液V(CCl4)∶V(CHCl3)=3∶1進行萃取脫色;所有的樣品在勻漿后,10000r/min,4℃離心10～20min,離心后取上清直接測定或儲藏于-20℃?zhèn)溆?。POD的活性測定采用愈創(chuàng)木酚法,以單位鮮重的每分鐘光吸收度的變化值為酶活力,即△OD470nm/(min·g)表示;采用Bradford比色法于595nm處測定可溶性蛋白含量,以小牛血清蛋白作標準曲線;用β-極限糊精法測定α-淀粉酶活性,測定波長為560nm,酶活單位為:μg/(h·g);PAL的活性測定采用巰基乙醇法,酶活單位為:ΔOD290nm/(h·g);H2O2含量的測定用硫酸鈦法,測定波長為410nm,以其消光系數(shù)ξ=0.28L/(mol·cm)計算其含量,單位為mmol/g。1.2.2酶同工酶電泳采用垂直板聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳方法,電泳完后參照胡能書的方法,POD用聯(lián)苯胺染色,α-淀粉酶用稀碘液顯色。2結果與分析2.13-淀粉酶活性由表1可以看出,所測的POD活性在3種植物中雖有差異,但變化趨勢相同,根的POD活性都比較高,其次是莖、花、葉,由于在試驗期,獨行菜花的采集較為困難而缺失花的數(shù)據(jù)。α-淀粉酶在薺菜的花、播娘蒿葉和花、獨行菜的根中有較高的活性,且獨行菜各器官中α-淀粉酶活性較其他2種植物都高;薺菜根PAL活性明顯比其他2種植物要高,而薺菜和播娘蒿莖的PAL活性也相對較高,在播娘蒿和獨行菜葉中不能檢測到PAL活性。2.23播關于在菜中的可溶性蛋白表2中可溶性蛋白含量在薺菜各器官中表現(xiàn)為根<莖<葉<花,在獨行菜中趨勢也類似,播娘蒿各器官中可溶性蛋白含量極高,其中根和花器官中尤其明顯。在薺菜葉和播娘蒿花中H2O2含量較高,而它們根中由于H2O2含量太低而無法檢測到。2.33不同枝、葉、花、根、莖、葉從圖1Ⅰ、Ⅱ可以看出,不同植物不同器官POD、α-淀粉酶同工酶譜條帶不同,如Ⅰ中薺菜根有3條主帶,莖有4條主帶,花有4條主帶,其中根、莖、花有3條共有酶帶;獨行菜根、莖、葉有3條共有酶帶,其分別有6,3,4條主帶;播娘蒿根、莖有3條主帶,葉、花有2條主帶,它們有2條共有條帶;Ⅱ中薺菜根、莖、葉、花中有2～4條主帶,有2條共有條帶;獨行菜中只有1條主帶;播娘蒿的莖、葉、花器官有共有條帶,而根有其獨特條帶。顯示了其組織特異性和種間差異。3pod與播婆蒿、自由生長的同工酶譜帶十字花科植物全世界約375屬,3200種,我國有95屬約400種,其中大多數(shù)是重要的經濟作物和藥用植物。本試驗首次探索了3種既可食用又可藥用的十字花科植物,花期的根、莖、葉、花4種器官的POD,PAL,α-淀粉酶等生化指標。試驗結果表明:3種植物的不同器官中均有較高的POD活性,尤其是根和莖中的POD活性較高,3種植物中又以薺菜根的POD活性最高。由于POD是一類重要的氧化還原酶類,參與植物許多生長發(fā)育過程。根中較高的POD活性是由于根部與土壤環(huán)境的接觸最為直接和密切,其主要功能是吸收養(yǎng)分和貯存物質以及抵御外界傷害性刺激,較高的POD活性可以對抗因環(huán)境改變造成的植物體內的活性氧上升,對植物起到保護作用。而且POD催化木質素生物合成中最后一步反應,根和莖部木質化程度較高,較高的POD活性與其功能相適應。POD也參與葉綠素的降解,因此葉中的POD活性較低。同工酶譜常被用于種質資源和遺傳進化的研究,POD同工酶譜已用于多種十字花科植物如大白菜、油菜、諸葛菜、藍花子等的分類及品種鑒定,相同的品種有相同的同工酶譜帶。本試驗所研究的3種植物也具有相同的POD同工酶譜帶(Rf=0.35),但是,薺菜的POD同工酶譜帶以較大的核質比譜帶為主,而獨行菜和播娘蒿的同工酶譜帶則主要為核質比較小的條帶。后兩者的種子是中藥葶藶子,其主要成分是由芥子酸和膽堿生成的酯類物質芥子堿(sinapine)。芥子堿是一種非常有價值的天然抗氧化劑,在抗衰老藥物的研究中具有重要意義。由此可見,POD同工酶譜不僅可以作為分類依據(jù),也可以研究植物的功用,具有相同藥理作用的植物可以有類似的同工酶譜。本試驗結果表明,PAL在3種植物中除了在薺菜根部的活性最高外,莖中活性較高,由于PAL與細胞分化也有很大關系,而PAL催化的苯丙烷類代謝中生成的肉硅酸等中間產物又可進一步轉化為木質素、香豆素、阿魏酸、綠原酸、類黃酮、生物堿等次生代謝產物,其中阿魏酸、芥子酸等中間產物,具有重要的藥用價值:阿魏酸能治療多種心腦血管疾病;Rubery和Notheote在多種植物中發(fā)現(xiàn)在木質化組織中含有較高的PAL活性,木質素含量與PAL,POD活性成正相關。莖的主要功能是在根和葉等組織間運輸物質,且隨著植物的不斷生長,其木質化速度也隨之加快,故其PAL活性較高。由于PAL參與的苯丙烷類代謝途徑所產生的許多藥用成分如香豆素、阿魏酸等也是POD的底物。本試驗證明,獨行菜和播娘蒿的根中的POD活性較高而莖中PAL活性較高,從而有利于植物的藥用成分積累。播娘蒿、獨行菜的特征性成分黃酮類,具有抗氧化、抗癌及抗微生物和除臭的功能,與該兩種植物止血、消炎的功效有關。晁志等研究發(fā)現(xiàn),益母草中生物堿成分對大鼠有利尿作用。本試驗供試植物薺菜、獨行菜和播娘蒿中的膽堿、乙酰膽堿等都屬于該成分,由此推測這3種植物的清熱利尿之效可能與其中的生物堿成分有關。本試驗結果表明,POD和PAL活性高的器官其H2O2含量則低,由于H2O2是一種活性氧,它可以生成極具破壞性的OH,OH可啟動連續(xù)性的脂質過氧化作用,不僅只是細胞代謝中有害的副產品,它同時對植物抗病基因的表達和局部細胞的凋亡具有重要的調控作用,且H2O2是POD的特異性底物,PAL也是植物體內的一種重要的抗性酶,在植物的生長發(fā)育過程和抗病蟲中起著非常重要的作用,其產物阿魏酸對活性氧如OH,O??2Ο2-?和H2O2有較強的清除能力。另外苯丙烷類代謝的大量產物直接或間接地為POD提供了氫供體,如POD參與阿魏酸等酚類化合物的氧化。薺菜的POD和PAL含量在根、莖、葉、花器官中較高,從而證實了薺菜全株入藥的正確性。本試驗結果顯示,可溶性蛋白在葉和花中含量較高,是由于葉是光合器官,雖然葉中可溶性蛋白含量較高,但其光合酶系統(tǒng)占主要成分,使得其他酶含量較低?；ㄊ侵参锏纳称鞴?是在花期代謝最旺盛的器官。不僅其可溶性蛋白含量高而且淀粉酶活性也高,為其提供了物質基礎。這也是花具有較高營養(yǎng)價值的原因。根和莖部也含有較高的α-淀粉酶活性,可使其貯存的淀粉迅速分解,從而為植株的生長發(fā)育和其他物質的合成提供能量和碳骨架,糖的分解也為POD提供氫供體。而葉相對較低的淀粉酶活性使得葉有利于將新合成的單糖或寡糖轉運到其他器官。本試驗結果顯示獨行菜和播娘蒿具有較高的淀粉酶活性和相對集中的同工酶譜帶,而