高質(zhì)量質(zhì)粒dna提取的原理與方法

高質(zhì)量質(zhì)粒dna提取的原理與方法

單粒是存在于細菌染色體之外的一個或多個雙殼狀氮顆粒的圓形dna。它可以運輸信息，控制一些特定的細菌遺傳特征，如性菌毛的形成、耐藥性、細菌素和抗生素。質(zhì)粒能獨立自行復制,隨細菌的分裂轉(zhuǎn)移到子代細胞中。質(zhì)粒還可通過接合或轉(zhuǎn)導的方式在細菌間傳遞。醫(yī)學上重要的質(zhì)粒有耐藥性質(zhì)粒(R質(zhì)粒)、致育性質(zhì)粒(F質(zhì)粒)和毒力質(zhì)粒(Vi質(zhì)粒)等。其分子質(zhì)量在0.2～10kD范圍內(nèi)。質(zhì)粒由于分子小,便于分離和提取,可以攜帶目的基因進入細菌、動物細胞或植物體內(nèi)進行擴增與表達,因此是基因工程中一種非常重要的載體,質(zhì)粒特征的分析已被廣泛用于細菌種屬鑒定、耐藥性、毒力及同源性等分析。近年來由于基因芯片技術(shù)的出現(xiàn),質(zhì)粒基因探針的開發(fā)和應(yīng)用也得到了飛速的發(fā)展。所有這些都需要我們獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。雖然質(zhì)粒提取是分子生物學實驗室一項最基本的工作,目前常規(guī)應(yīng)用的質(zhì)粒DNA分離純化主要有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有機溶劑法等,但上述方法都或多或少存在一定問題,很難獲得高純度的質(zhì)粒DNA。盡管現(xiàn)在質(zhì)粒抽提試劑盒已經(jīng)廣泛使用,但獲得高純度、大量的質(zhì)粒DNA,特別是大分子質(zhì)量、低拷貝的質(zhì)粒DNA仍然比較困難。作者認為要獲得高純度的質(zhì)粒DNA,需要試驗者理解質(zhì)粒提取的原理,針對不同菌種、不同性質(zhì)和大小的質(zhì)粒,選用恰當?shù)姆椒?有效地控制提取過程中的各種影響因素,才能達到目的。1質(zhì)粒的沉淀thill-pcr首先我們必須理解所用到的每一種試劑的真正目的:50mM葡萄糖:葡萄糖加入后只是使懸浮后的菌體不會快速沉積到管子的底部。10mM的EDTA:目的是與菌體細胞中二價金屬離子螯合,從而抑制DNA酶的活性和微生物生長。NaOH:裂解細菌。十二烷基硫酸鈉(SDS):通過鉀離子置換SDS中的鈉離子形成不溶性的十二烷基硫酸鉀(PDS),而SDS又專性和蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子,因此鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀,同時菌體的基因組DNA也一起被共沉淀。酚/氯仿/異戊醇、酒精:沉淀蛋白質(zhì)。醋酸:中和NaOH,防止堿性條件質(zhì)粒DNA的斷裂。從每種試劑的作用我們不難看出:如果溶液中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言,幾乎沒有影響,所以說葡萄糖是可缺的。只要是在較短的時間里完成質(zhì)粒抽提,DNA就不會被迅速降解,不加EDTA,問題也不大,因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。0.4NNaOH要從濃溶液新鮮稀釋制備,這樣可保證NaOH沒有因為吸收空氣中的CO2而使堿性降低,保證其裂解細菌的能力。NaOH裂解細菌時要注意時間不能過長,操作必須柔和,因為在強堿會導致基因組DNA片段的斷裂,劇烈的機械振動也會使基因組DNA斷裂。大量基因組DNA片段混入會影響質(zhì)粒DNA提取的純度。酚/氯仿/異戊醇選用25:24:1的比例是使蛋白質(zhì)沉淀的最佳條件。抽提的質(zhì)粒樣品要用含RNA酶(50μg/mL)的TE緩沖液進行溶解,否則大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果。質(zhì)粒DNA的純化可選用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主基因組DNA的方法。2小分子質(zhì)量質(zhì)粒的制備選擇哪一種方法提取質(zhì)粒主要取決于3個因素:質(zhì)粒分子質(zhì)量的大小、細菌的種屬及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。盡管要對質(zhì)粒的種類和宿主菌的種屬分別提出最佳的分離條件難以做到,但仍可根據(jù)下列原則來選擇適當方法,以取得滿意的結(jié)果。大于15kb的大質(zhì)粒在抽提過程中容易受損,故應(yīng)采用溫和裂解法從菌體中釋放出來。將細菌懸于等滲的糖溶液中,然后用溶菌酶和EDTA進行處理,破壞細胞壁和細胞外膜,再加入去垢劑溶解。這種方法最大限度地緩沖了高滲透壓的細菌質(zhì)粒釋放時的壓力。小分子質(zhì)量質(zhì)粒可以選用較劇烈的方法來分離。加入EDTA后,有時還可以在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去垢劑,或通過煮沸和堿處理使細菌裂解。這些方法可破壞堿基配對,故可使宿主的線狀染色體DNA變性,但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復正常時,質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確配對,重新形成天然的超螺旋分子。一些菌株用去垢劑或加熱裂解時可釋放較多的糖類,而糖會在密度梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA中混有糖,而糖可抑制多種限制酶的活性。這類菌株制備質(zhì)粒時,不宜使用煮沸法。具有限制性核酸內(nèi)切酶A的菌株不宜使用煮沸法。因為煮沸不能完全滅活內(nèi)切酶A,以后再用限制性內(nèi)切酶消化時,質(zhì)粒DNA會被降解。此時必須用酚:氯仿進行抽提。在細菌繁殖的對數(shù)生長期中期加入氯霉素可以增加質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù),也可以抑制在需要大量制備質(zhì)粒時,細菌增長過多,便于質(zhì)粒的抽提。在質(zhì)粒提取方法的選擇方面,煮沸法時間短,操作簡單,但條件過于劇烈,易造成質(zhì)粒斷裂、收率較低。堿裂解法操作簡單,所得質(zhì)粒量較多且污染少,但是花費的時間較長并目要求冰浴。具體選擇何種方法提取,應(yīng)結(jié)合自己的菌種以及含有的質(zhì)粒的特性綜合進行選用,每一種方法都不是萬能的,每一種方法都有其優(yōu)缺點。3質(zhì)粒的提取不是容易進行物質(zhì)相對于傳統(tǒng)的質(zhì)粒提取方法,目前有多種改良的方法,但其本質(zhì)都是針對某種細菌的質(zhì)粒DNA的特性,根據(jù)提取原理進行的改進,不一定具有通用性。應(yīng)用試劑盒提取質(zhì)粒,雖然非常方便,重復性好,但是由于試劑盒的步驟進行