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核因子-b受體活化因子rankl骨保護(hù)素與人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)
隨著人工關(guān)節(jié)材料和相關(guān)手術(shù)技術(shù)的快速發(fā)展,人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療各種終末期關(guān)節(jié)疾病最常用的有效治療方法。然而,人工關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)溶解導(dǎo)致的無(wú)菌性松動(dòng)仍未得到很好解決,已成為影響人工關(guān)節(jié)置換術(shù)遠(yuǎn)期療效的重要難題。近年研究表明,人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生與力學(xué)因素和生物學(xué)因素相關(guān),以生物學(xué)因素為主要因素。人工關(guān)節(jié)置入人體后,隨著關(guān)節(jié)活動(dòng),會(huì)產(chǎn)生大量磨損顆粒,這些顆粒誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生生物學(xué)反應(yīng),促使人工關(guān)節(jié)與骨之間形成界膜組織,并隨著磨損顆粒和骨細(xì)胞吸收刺激因子的增加,引起界膜組織中各種骨吸收因子的釋放和破骨細(xì)胞的分化和活化,最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)周?chē)侨芙狻T谶@一過(guò)程中,對(duì)破骨細(xì)胞分化、活化和凋亡起重要作用的是核因子-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)/骨保護(hù)素(OPG)信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。因此,深入研究RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)調(diào)控破骨細(xì)胞分化、成熟和凋亡,以及人工關(guān)節(jié)周?chē)侨芙獾臋C(jī)制,對(duì)于開(kāi)發(fā)人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)防治新途徑有著重要意義。1rakenl基因生物活性RANK是在人骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞基因序列測(cè)評(píng)中發(fā)現(xiàn)的一種Ⅰ型跨膜蛋白,人RANK基因定位于18q22.1,屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族。人RANK分子由616個(gè)氨基酸殘基組成,其N(xiāo)末端胞外域有2個(gè)糖基化位點(diǎn)和4個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域。RANK編碼的蛋白在體內(nèi)有跨膜蛋白型和可溶型兩種存在方式,前者表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞系、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等細(xì)胞表面,其中表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK會(huì)與RANKL結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的功能;后者存在于血液循環(huán)中,可與RANKL結(jié)合,但對(duì)破骨細(xì)胞分化起抑制作用。RANK與RANKL結(jié)合后,通過(guò)TNF受體相關(guān)因子(TRAF)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。RANK含有3個(gè)與TRAF結(jié)合的區(qū)域,分別與TRAF2、TRAF5、TRAF6相結(jié)合,作為信使傳遞RANK刺激信號(hào),并激活核因子-κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、Src途徑。TRAF6對(duì)維持破骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞骨架形成和骨吸收作用,均必不可少。RANKL是TNF-α超家族成員,破骨細(xì)胞基因表達(dá)時(shí)必須有其存在。作為一種Ⅱ型跨膜蛋白,目前發(fā)現(xiàn)RANK在體內(nèi)有3種存在方式,即跨膜結(jié)合蛋白、跨膜結(jié)合蛋白在140或145位置經(jīng)酶切后由外部區(qū)域重組形成的游離型多肽,以及膜結(jié)合蛋白胞外C端脫落形成的具有生物活性的可溶性分子。人和大鼠RANKL分子分別包含317、316個(gè)氨基酸殘基,具有87%同源性。人RANKL基因位于13q14,其啟動(dòng)子區(qū)含有成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子-α1(Cbf-α1)的結(jié)合位點(diǎn),RANKL表達(dá)依賴于Cbf-α1的活性,這可能是RANKL偶聯(lián)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的關(guān)鍵所在,但具體機(jī)制尚不清楚。RANKLmRNA可在多種組織表達(dá),以在骨骼和淋巴組織中表達(dá)最高。骨骼中RANKL主要表達(dá)于骨小梁和骨髓,骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中也可檢測(cè)到RANKLmRNA。RANKL在體內(nèi)分布廣泛,但動(dòng)物試驗(yàn)顯示注射RANKL后僅在骨組織中發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞,其他組織內(nèi)則未發(fā)現(xiàn),這提示骨組織微環(huán)境中含有破骨細(xì)胞分化所必需的其他因子。RANKL是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、發(fā)揮功能的因子。小鼠RANKL基因敲除后體內(nèi)出現(xiàn)廣泛骨硬化、生長(zhǎng)停滯、牙齒萌出障礙及缺乏成熟的破骨細(xì)胞,給予RANKL后癥狀改善,而應(yīng)用重組RANKL后則出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松和高鈣血癥。在體外巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)存在條件下,單純給予RANKL即可使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。RANKL不僅促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,而且呈劑量依賴性地激活成熟的破骨細(xì)胞,延長(zhǎng)其存活時(shí)間,提高其運(yùn)動(dòng)和形成骨吸收陷窩的能力。可見(jiàn),RANKL是調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子。OPG是在對(duì)胎鼠小腸cDNA測(cè)序分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的序列蛋白,編碼含401個(gè)氨基酸殘基,也是TNF-α受體超家族成員,可調(diào)節(jié)RANKL的生物活性。作為一種分泌型糖蛋白,OPG以單體形式在胞內(nèi)合成,以雙體形式分泌到胞外,兩種形式在加工過(guò)程中均切除21個(gè)氨基酸信號(hào)肽,形成含380個(gè)氨基酸殘基的成肽。人OPG是單拷貝基因,位于8q23-24上,含有5個(gè)外顯子,1個(gè)主要轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和2個(gè)次要轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。OPG分子包含7個(gè)主要結(jié)構(gòu)域,其N(xiāo)’端包含4個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域(D1~D4),為其主要功能域;C’端含2個(gè)死亡對(duì)應(yīng)域(D5、D6),可轉(zhuǎn)導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡信號(hào)。人體骨組織OPG主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生,淋巴細(xì)胞和乳腺也可產(chǎn)生,其表達(dá)量與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)。OPG具有抑制骨吸收的功能,通過(guò)與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL抑制破骨細(xì)胞分化及成熟破骨細(xì)胞活性,并誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞調(diào)亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,OPG轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出骨硬化癥,OPG基因敲除小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥。體外研究顯示,10ng/ml重組OPG可完全抑制動(dòng)物破骨細(xì)胞生成,成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)中加入RANKL可形成功能完整的破骨細(xì)胞,加入OPG則完全抑制破骨細(xì)胞功能。此外,OPG表達(dá)水平還受雌激素的影響,雌激素減少將引起OPG表達(dá)下降,從而導(dǎo)致其與RANKL的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用減弱。預(yù)防小鼠卵巢切除后骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予小鼠注射OPG能有效預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生。以上研究進(jìn)一步提示,OPG在破骨細(xì)胞調(diào)控過(guò)程中起重要作用。2骨溶解及人工關(guān)節(jié)導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的主要原因,如力學(xué)因素,包括人工關(guān)節(jié)界面微動(dòng)、液壓、應(yīng)力遮擋、磨損等;生物學(xué)因素,包括人工關(guān)節(jié)生物相容性、內(nèi)毒素、磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解等。目前大部分學(xué)者認(rèn)為,磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解為關(guān)鍵因素。大量臨床和基礎(chǔ)研究表明,人工關(guān)節(jié)磨損可產(chǎn)生大量異物顆粒,而這些顆粒引發(fā)的生物學(xué)反應(yīng)是人工關(guān)節(jié)周?chē)霈F(xiàn)骨溶解的主要原因。界膜的出現(xiàn)是骨溶解病理過(guò)程的顯著特征之一,界膜中含有大量單核-巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、異物巨細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等。界膜細(xì)胞在磨損顆粒作用下產(chǎn)生各種骨吸收刺激因子,最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和活化。這種骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)、骨形成活動(dòng)降低的情況,可破壞骨吸收與骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡,最終導(dǎo)致骨溶解和人工關(guān)節(jié)松動(dòng)。Ramage等對(duì)人工關(guān)節(jié)周?chē)M織進(jìn)行免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)人工關(guān)節(jié)周?chē)缒ぶ写嬖谀軌蛘{(diào)節(jié)骨吸收的RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)。Veigl等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RANKL只在含有大量磨損顆粒的人工關(guān)節(jié)周?chē)M織中高表達(dá)。相關(guān)研究還表明,不僅從人工關(guān)節(jié)周?chē)M織分離的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)RANKL,而且界膜分泌的滑液中也有RANKL存在;在沒(méi)有成骨細(xì)胞參與的情況下,在分離的巨噬細(xì)胞中單純加入外源性RANKL,即被誘導(dǎo)成多核破骨細(xì)胞樣細(xì)胞,加入外源性O(shè)PG后這一誘導(dǎo)過(guò)程被抑制;將分離的成纖維細(xì)胞、滑液分別與人單核細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)有能引起骨基質(zhì)吸收的多核細(xì)胞產(chǎn)生。有研究將聚乙烯顆粒分別植入RANK敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠顱骨中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者出現(xiàn)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),但顱骨周?chē)匆?jiàn)破骨細(xì)胞,且無(wú)骨吸收發(fā)生,而后者則產(chǎn)生大量破骨細(xì)胞并出現(xiàn)骨吸收。Masui等研究發(fā)現(xiàn),人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后人工關(guān)節(jié)周?chē)p顆??梢餜ANKL-OPG的比值增加,從而導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)。這說(shuō)明RANKL-OPG比例的失衡與人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解存在密切相關(guān)性。以上研究結(jié)果說(shuō)明,人工關(guān)節(jié)周?chē)缒そM織中的細(xì)胞在多種因素聯(lián)合作用下,通過(guò)影響周?chē)M織內(nèi)RANK、RANKL、OPG的表達(dá),破壞RANKL和OPG平衡狀態(tài),引起RANKL-OPG比例失衡,介導(dǎo)破骨細(xì)胞進(jìn)一步分化、活化,最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)周?chē)植抗谴x不平衡及骨溶解。3骨吸收因子作用在人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)機(jī)制中,RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)是各種骨吸收刺激因子作用的直接或間接靶點(diǎn)。磨損顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種骨吸收因子,最終均通過(guò)影響RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)來(lái)激活破骨細(xì)胞并促進(jìn)人工關(guān)節(jié)周?chē)侨芙?。因?通過(guò)基因治療途徑來(lái)阻斷該系統(tǒng)過(guò)度活躍,成為防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)研究的新方向。3.1raken基因敲除小鼠骨RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)在其觸發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到連接細(xì)胞內(nèi)外的橋梁作用。無(wú)菌性松動(dòng)的人工關(guān)節(jié)周?chē)M織中RANKL和RANK的表達(dá)明顯增多,增多的RANK與RANKL相互結(jié)合后,激活的RANK將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、活化,最終導(dǎo)致骨溶解。Ren等利用RANK基因敲除小鼠建立植骨氣囊模型,研究RANK在人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)中的作用,14d后發(fā)現(xiàn)RANK基因敲除小鼠氣囊產(chǎn)生明顯炎癥,白細(xì)胞介素(IL)-β、TNF-α及RANKL表達(dá)明顯升高,但氣囊壁耐酒石酸鹽酸性磷酸酶染色未見(jiàn)破骨細(xì)胞,植入骨也未見(jiàn)骨吸收;這表明RANK基因敲除雖不能抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),但可有效阻斷破骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵信號(hào)通路,即RANKL與RANK的結(jié)合,從而抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。3.2rakenl基因回復(fù)突變?cè)囼?yàn)RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合后,可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引起級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng),最終促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、活化,阻止破骨細(xì)胞凋亡。RANKL是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞的必需因子。人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)中的磨損顆??烧T導(dǎo)周?chē)M織高表達(dá)RANKL,使RANKL/RANK信號(hào)通路增強(qiáng)。高延征等研究發(fā)現(xiàn),體外RNA干擾技術(shù)抑制大鼠成骨細(xì)胞RANKL表達(dá),并不會(huì)影響OPG、Ⅰ型膠原表達(dá)及細(xì)胞增殖。高坤等將成功接受過(guò)RNA干擾技術(shù)且RANKL基因沉默的成骨細(xì)胞與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行RANKL基因沉默可顯著抑制破骨細(xì)胞生成;這表明破骨細(xì)胞的生成很大程度上依賴于成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL,降低RANKL表達(dá)可有效阻斷骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。因此,可嘗試通過(guò)基因治療途徑抑制人工關(guān)節(jié)周?chē)M織RANKL基因的表達(dá),阻斷RANKL/RANK信號(hào)通路的激活,從而防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)。3.3opg基因?qū)M織中rangl表達(dá)的調(diào)控OPG是RANKL的餌受體,通過(guò)與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,阻斷RANK/RANKL信號(hào)通路,最終阻斷破骨細(xì)胞的分化、活化,抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。因此,增強(qiáng)OPG基因的表達(dá),是抑制人工關(guān)節(jié)周?chē)侨芙獾闹匾緩健lrich-Vinther等研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)OPG的重組腺病毒相關(guān)病毒載體能成功轉(zhuǎn)染胚腎細(xì)胞293,并表達(dá)一定量的OPG;將表達(dá)OPG的重組腺病毒相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞與RANK和M-CSF誘導(dǎo)的脾細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示表達(dá)OPG的成纖維細(xì)胞顯著抑制脾細(xì)胞的破骨細(xì)胞生成率;用表達(dá)OPG的重組腺病毒相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠顱蓋骨肌細(xì)胞,結(jié)果示血漿OPG濃度于第2天開(kāi)始升高,第6天達(dá)峰值,并明顯抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的骨重吸收和破骨細(xì)胞生成。Goater等將穩(wěn)定表達(dá)OPG基因的滑膜細(xì)胞和鈦顆粒一起植入小鼠顱蓋,發(fā)現(xiàn)表達(dá)少量OPG的滑膜細(xì)胞卻能有效抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨溶解,表明OPG在抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解中具有高效性。Yang等用編碼人OPG基因的腺病毒相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物氣囊模型,7d后發(fā)現(xiàn)OPG表達(dá)明顯上升,而調(diào)控破骨細(xì)胞分化、成熟及激活的關(guān)鍵因子RANK表達(dá)下降,骨鈣釋放減少30%,骨膠原丟失減少;表明OPG不僅可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,還可下調(diào)組織中RANKL基因的表達(dá),即OPG可通過(guò)兩種不同途徑抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。Zhang等在一項(xiàng)腺病毒相關(guān)病毒介導(dǎo)的OPG基因局部療法防治膝人工關(guān)節(jié)松動(dòng)有效性研究中發(fā)現(xiàn),OPG基因在人工關(guān)節(jié)周?chē)磉_(dá)良好,在其他器官中表達(dá)未受影響;局部表達(dá)的OPG不僅能明顯減少破骨細(xì)胞數(shù)量,抑制骨膠原丟失,還能降低周?chē)M織TNF、IL、肌酸磷酸激酶(CPK)和RANKL表達(dá)。以上研究表明,增強(qiáng)人工關(guān)節(jié)周?chē)鶲PG基因表達(dá),不僅能高效阻斷RANK/RANKL信號(hào)通路,減少破骨細(xì)胞活化,還可降低周?chē)M織TNF、IL、CPK和RANKL表達(dá),抑制骨溶解。以O(shè)PG為靶點(diǎn)的基因治療,是防治人工關(guān)節(jié)周?chē)侨芙獾挠行緩健?raken/rangl/opg系統(tǒng)作為調(diào)控破骨細(xì)胞分化、活化和凋亡的重
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