Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)

-.z.Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)試劑盒容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方法基于讓已經(jīng)轉(zhuǎn)入桿狀病的質(zhì)粒（桿粒）的位點特意轉(zhuǎn)座子的表達框的質(zhì)粒在Ecoli中擴增。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)主要包括：*pFastBac捐獻質(zhì)粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目的位點的表達結(jié)構(gòu)，這個目的基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點啟動子控制。*一個Ecoli宿主，DH10Bac，包含桿狀病毒質(zhì)粒（桿粒）和輔助質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染pFastBac表達結(jié)構(gòu)后可以產(chǎn)生重組桿粒。*一個控制表達的質(zhì)粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染細胞后產(chǎn)生重組桿狀病毒，表達β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的優(yōu)點：使用這個系統(tǒng)產(chǎn)生重組桿狀病毒較傳統(tǒng)的同源重組有以下優(yōu)點：*與使用同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒所需的4-6周相比，鑒別純化重組病毒少于兩周*減少了從斑點篩選重組病毒DNA所包含親緣和非重組病毒的幾率*可以快速同時進行大量重組，適合表達功能性研究的蛋白選擇pFastBac菌體（Vector）：大量的pFastBac菌體都適于進行Bac-to-Bac表達系統(tǒng)。選擇對于你的需要最合適的菌體。Vector特點參考pFastBacTM1高水平表達的強AcMNPV聚乙烯（PH）啟動子用于簡單克隆的大量克隆位點Anderon1996pFastBacTMHT高水平表達的聚乙烯啟動子；N-末端含有6*His，可以用來純化重組蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3個閱讀框Polayes1996pFastBacTMDual兩個強啟動子（PH和p10）可以同時表達兩種蛋白；兩個大的克隆位點Harris和Polaye1997指南用途：指南提供了一個對于Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的概述，并對以下提供指導：克隆目的基因到pFastBacTM供體質(zhì)粒的選擇轉(zhuǎn)化pFastBacTM結(jié)構(gòu)到最高效的DH10BacTM產(chǎn)生重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒DNA到昆蟲細胞產(chǎn)生重組桿狀病毒擴增滴定（Amplifyandtiter）桿狀病毒株，使用病毒株感染昆蟲細胞表達目的重組蛋白重要的：Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是用來幫助你產(chǎn)生重組桿狀病毒，在昆蟲細胞中進行高水平表達目的基因的系統(tǒng)。雖然他可以幫助你很容易的產(chǎn)生桿狀病毒表達你的重組蛋白，但是使用這系統(tǒng)更傾向于有桿狀病毒生物學和昆蟲表達背景的使用者。我們高度推薦使用者具有病毒和組織培養(yǎng)的技術(shù)和知識。Bac-to-Bac表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)的成分：表達系統(tǒng)簡單高效的產(chǎn)生重組桿狀不能給黨?；贚uckow1993年的方法，此系統(tǒng)利用了位點特意的專座子Tn7區(qū)簡化和提高重組質(zhì)粒DNA*系統(tǒng)的第一個成分是用來克隆目的基因的pFastBacTM菌株?；趐FastBacTM菌株的選擇，表達基因被AcMNPV的PH或p10啟動子控制，在昆蟲細胞高水平表達表達框被Tn7的左右臂包圍，并且包含一個慶大霉素抗性點和SV40多腺苷酸化信號，形成一個微型的Tn7*第二個主要結(jié)構(gòu)是Ecoli的DH10BacTM品系，用來作為pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacTM細胞包含帶有微型-attTn7靶位點的病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（詳細見下文）。一旦pFastBacTM表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac細胞，轉(zhuǎn)化就會發(fā)生在pFastBacTM菌株的微型Tn7單位和微型-attTn7的靶位點之間產(chǎn)生重組質(zhì)粒。這個轉(zhuǎn)化反應發(fā)生在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)化蛋白處。如果你已經(jīng)完成了轉(zhuǎn)化反應，你需要分離這個高分子量的重組質(zhì)粒DNA并將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染如昆蟲細胞趨產(chǎn)生重組桿狀病毒，用來進行初步表達實驗。在桿狀病毒株擴增和滴定后，高效價的病毒株可以用來感染細胞，進行大規(guī)模的重組蛋白的表達。桿狀病毒菌株：病毒菌株（桿粒），bMON14272(136KB)，在DH10BacEcoli中包括：*一個低拷貝的微型F復制子*卡那霉素的抗性標記*一個來自于pUC載體的編碼LacZa肽的DNA片段，用來接觸病毒轉(zhuǎn)座子，Tn7（微型attTn7）已經(jīng)被插入。插入的微型attTn7不會中斷LacZa肽的閱讀框。桿粒在具有卡那抗性的大的質(zhì)粒EcoliDH10Bac中擴增，在顯色物質(zhì)如Bluo-gal或*-gal和誘導劑IPTG存在時，能補充染色體LacZ的缺失形成藍斑（LacZ+）輔助質(zhì)粒：DH10BacEcoli也包含輔助質(zhì)粒，pMON7124(13.2kb)，他編碼轉(zhuǎn)移酶和四環(huán)素抗性基因。這個輔助質(zhì)粒提供Tn7轉(zhuǎn)化功能。圖示Bac-toBac系統(tǒng)：下圖刻畫了重組病毒的產(chǎn)生和目的基因的表達實驗輪廓：流程：下圖揭示了表達目的基因的一般步驟pFastBacdonor質(zhì)粒（步驟：目的基因的克隆）得到pFastBac重組體（轉(zhuǎn)化至DN10Bac細胞（含有桿粒和helper））得到含有重組桿粒的Ecoli細胞（重新劃線）得到驗證過的含有重組桿粒的Ecoli細胞（過夜培養(yǎng)，分離重組桿粒DNA）得到重組桿粒DNA（使用Cellfectin試劑感染細胞）得到P1重組桿狀病毒株（＞106pfu/ml）（感染昆蟲細胞擴增病毒）得到P2重組桿狀病毒株（＞107pfu/ml）（滴定感染昆蟲細胞）得到蛋白的表達培養(yǎng)昆蟲細胞：一般指導：介紹：對于您的桿狀病毒轉(zhuǎn)移菌，我們推薦使用Sf9和Sf21昆蟲細胞作為宿主。在開始你的轉(zhuǎn)化試驗和表達之前，確定你有收獲的Sf9和Sf21，并將其凍存。使用無血清的介質(zhì)：昆蟲細胞可能在無血清的條件下收獲。我們推薦使用Sf900ⅡSFM。Sf900ⅡSFM對于維持Sf9和Sf21以及對于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，都是無蛋白的最優(yōu)的介質(zhì)。昆蟲細胞培養(yǎng)參考指導：維持和傳代昆蟲細胞在貼壁和懸浮條件下冷凍細胞使用無血清的介質(zhì)按比例增加細胞產(chǎn)量一般指導：昆蟲細胞對于環(huán)境很敏感，此外化學和營養(yǎng)因素，物理因素都可以影響昆蟲細胞的成長。需要優(yōu)化以得到最大產(chǎn)量?？紤]以下培養(yǎng)條件：*溫度：細胞的感染和成長的最適合圍是27-28度*PH：對于許多培養(yǎng)系統(tǒng)6.1-6.4時合適的圍。Sf900ⅡSFM在此圍支持一般的空氣和開蓋培養(yǎng)*同滲重摩：鱗翅類細胞使用介質(zhì)的最優(yōu)同滲重摩是345-380mOsm/kg*通風：對于最優(yōu)生長條件和蛋白的表達，昆蟲細胞要求被動的通氧。積極的通氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%*剪切力：懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生機械剪切力。生長的昆蟲細胞在含有血清的介質(zhì)中（10%-20%FBS），對于細胞的剪切力一般會得到足夠的保護。如果你的細胞在無血清條件下生長，加入剪切力保護劑例如PluronicF-68。注意：在Sf900ⅡSFM中生長的細胞不需要加入剪切力保護劑。轉(zhuǎn)染的細胞：你需要的是對數(shù)期的細胞＞95%發(fā)育能力，可以完成成功的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生重組的pFastBacTM菌株（Vector）一般信息：介紹：為了產(chǎn)生包含目的基因的重組質(zhì)粒，使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，你需要使用限制酶消化和連接，將你的目的基因克隆進入pFastBac菌的其中一種。一般分子生物學技術(shù)：為了幫助限制酶消化和連接DNA的序列，需要其他一般的分子生物學技術(shù)擴增和保存質(zhì)粒：pFastBac菌種和他的相應的表達對照質(zhì)粒包含氨芐青霉素抗性基因，可以使用Ecoli進行Amp篩選。為了擴增和保存pFastBac和pFastBac對照質(zhì)粒，使用以下方法：使用載體株系感染一個recA,endAEcoli株，例如Top10，DH10B或者DH5α在含有100ug/mlAmp的LB瓊脂糖平板選擇轉(zhuǎn)化株。選擇含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子制備甘油菌以便長期保存克隆進入pFastBacTM1介紹：為了幫助你設計策略克隆你的目的基因進入pFastBacTM1，參考以下建議和表格克隆考慮事項：pFastBacTM1菌株是非融合菌株（無融合標簽）。為了保證重組蛋白的表達，你的插入必須含有：*一個ATG起始密碼子用于轉(zhuǎn)錄起始*一個終止密碼子。注意：終止密碼子包含在所有三個閱讀框中的多克隆位點中注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始ATG。一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測。pFastBacTM1的多克隆位點：下圖是pFastBacTM1的多克隆位點。限制位點標出來以便顯示實際切刻位點。潛在的終止密碼子下劃線表示。pFastBacTM1的全序列可以從下載。pFastBacTM1的圖譜和描述見后綴克隆進入pFastBacTMHTA，B，C介紹：pFastBacTMHT載體由三個讀碼框（A，B，C）提供的多克隆位點從而實現(xiàn)克隆目的基因，并且在N端帶有6*His?？寺。簆FastBacTMHT菌株是融合菌株。為了保證表達重組蛋白，你必須：*克隆你的基因要帶有ATG，位于4050-4052堿基對間。這個將會產(chǎn)生融合表達，帶有6*His標簽，可以用TEV切除*你的插入要含有終止密碼注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始ATG。一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測pFastBacTMHTA的多克隆位點：下圖是pFastBacTMHTA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點。pFastBacTMHTB的多克隆位點：下圖是pFastBacTMHTA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點。框住的核苷酸顯示出的是易變區(qū)域。pFastBacTMHTC的多克隆位點：下圖是pFastBacTMHTA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點。框住的核苷酸顯示出的是易變區(qū)域。注意pFastBacTMHTC在*baⅠ位點有一個終止密碼子，他在N端標簽框。確定你的基因的5`端是在*baⅠ位點上游開始。克隆進入pFastBacTMDual介紹：pFastBacTMDual包含兩個多克隆位點，可以同時表達兩個異源基因，一個通過PH啟動子控制，另一個通過P10啟動子控制。參見下列建議以便有助于你的基因克隆克隆事項：pFastBacTMDual是一個非融合載體。為了保證重組蛋白的表達，你的插入必須含有以下兩點*一個ATG起始密碼子*如果你不使用多克隆位點中的終止密碼子，就必須要有一個終止密碼子注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始ATG。一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。對于插入克隆上游的聚乙烯啟動子，注意到蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG（ATT），盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測。PH啟動子下游的多克隆位點：下圖是pFastBacTMDual中PH啟動子下游的多克隆位點的圖示。限制性位點標記出來顯示了實際的切刻位點。潛在的終止密碼子有下劃線標出。P10啟動子下游的多克隆位點：下圖是pFastBacTMDual的AcMNPVp10啟動子下游的多克隆位點。限制性位點標記出來以便顯示實際切刻位點。潛在的終止密碼子標記下劃線。轉(zhuǎn)化和分析介紹：如果你已經(jīng)完成了你的連接反應，你就要準備把你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化進Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和轉(zhuǎn)化程序都是可以使用的。一般推薦轉(zhuǎn)化Ecoli和分析轉(zhuǎn)化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆進入了pFastBacTM，你需要轉(zhuǎn)化連接反應到Ecoli，并選擇優(yōu)Amp抗性的轉(zhuǎn)化株。你可以使用任何recA，endAEcoli菌。包括Top10，DH10B或者DH5α進行轉(zhuǎn)化。不要轉(zhuǎn)化連接反應進入DH10Bac細胞。注意TOP10和DH10B感受態(tài)細胞可以從Invitrogen得到轉(zhuǎn)化方法：你可以選擇使用任何方法對Ecoli進行轉(zhuǎn)化。化學轉(zhuǎn)化是最便利的方法，而電轉(zhuǎn)對大質(zhì)粒是最有效的方法。選擇好轉(zhuǎn)化株，使用含有100ug/mlAmp的LB平板。轉(zhuǎn)化株分析：一旦你得到Amp抗性轉(zhuǎn)化株，我們有以下推薦：選出10個轉(zhuǎn)化株，在含有100ug/ml的Amp的LB或S.O.B培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)使用你選的方法分離質(zhì)粒DNA。我們推薦使用公司的試劑盒使用限制性方法分析質(zhì)粒，證明是重組質(zhì)粒并證明插入起始的正確。使用限制性酶或者酶化合物對Vector和插入端各進行一次酶切。使用PCR對轉(zhuǎn)化株進行分析：你也可以使用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化株進行分析。使用合適的PCR引物和Amp條件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行試驗。使用錯誤的引物或污染的平板可能會得到假象。以下方法可以給你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真PCRSuperMi*，合時的PCR前后引物過程：1、對于每個樣品，在0.5ml的小離心管加入48ul的高保真PCRSuperMi*和各1ul的前后引物。2、選出10個克隆，在上述離心管中進行重懸（記得做一個Patch板保護克隆以便進行更深的分析）3、94度10分鐘溶解細胞滅活核酸酶4、20-30個循環(huán)進行擴增5、延伸使用72度10分鐘。4度儲存6、瓊脂糖凝膠電泳檢測測序：對于你的結(jié)構(gòu)需要進行測序證明目的基因是正確的起始以便表達。如果你是將基因克隆進入了pFastBacTMHT，證明的基因進入了N末端標簽的讀框中。長期保存：一旦你證明了測序的正確，確定克隆的純度并制作甘油菌長期保存。推薦儲存質(zhì)粒DNA在-20度在含有100ug/ml的LB平板上對原始的克隆進行劃線培養(yǎng)挑單克隆在1-2ml含有Amp的LB撫育培養(yǎng)至穩(wěn)定期在0.85ml的培養(yǎng)物中混合0.15ml的過濾甘油，轉(zhuǎn)到冷凍小管-80度儲存重組質(zhì)粒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化到DH10BacEcoli介紹：一旦你有了你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)，你就可以準備轉(zhuǎn)化純化的質(zhì)粒DNA進入DH10BacTMEcoli，轉(zhuǎn)變成為桿粒。你可以使用藍/白斑選出含有重組桿粒的克隆。Bac-toBac表達系統(tǒng)提供高效DH10BacTM感受態(tài)細胞。陽性對照：每個pFastBacTM質(zhì)粒都提供相應的陽性對照用來作為陽性轉(zhuǎn)染和表達對照（下表）。根據(jù)pFastBacTMVecctor的使用，我們推薦在你的DH10Bac轉(zhuǎn)染試驗中作相應的對照。所需材料：開始之前你需要有以下材料*純化的pFastBacTM結(jié)構(gòu)（200pg/ul儲存于PH8.0的TE）*陽性表達對照*高效DH10BacTM感受態(tài)細胞（表達系統(tǒng)提供，每個轉(zhuǎn)化試驗使用1管細胞）*pUC19（與DH10Bac一起提供，用來做對照）*LB平板，包含Kan，Gen（慶大），Tetracycline（四環(huán)素），Bluo-gal（鹵代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和IPTG。（每個轉(zhuǎn)化3個板，使用新鮮平板，推薦見下文）*LB板含有100ug/mlAmp（用于pUC19轉(zhuǎn)化對照）*S.O.C介質(zhì)*15ml圓底塑料管*42度水域和37度搖床及37度培養(yǎng)箱。你需要準備LB瓊脂糖平板，包含50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG，用來進行DH10BacTM轉(zhuǎn)化株的篩選。可以從我公司預訂抗生素，Bbluo-gal，IPTG，在后面有制備平板的指導。如果你正準備的LB平板使用的是事先混合好的，我們推薦使用LuriaBrothBase代替LB。使用LB板將會降低顏色敏感度，并可能降低克隆的數(shù)量。注意：在藍/白斑篩選中使用Bluo-gal代替*-Gal。Bluo-gal產(chǎn)生的藍斑顏色要比*-Gal深。準備轉(zhuǎn)化：對于每個轉(zhuǎn)化，你都需要一小瓶感受態(tài)細胞和三個平板。*42度水域平衡*37度烘板30分鐘*室溫放置SOC介質(zhì)*對于每個轉(zhuǎn)化試驗預冷一個15ml管子轉(zhuǎn)化過程：按照以下過程用高效DH10BacTM感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化pFastBacTM結(jié)構(gòu)。我們推薦做陽性對照的轉(zhuǎn)化來幫助你證明你的結(jié)果。整管高效DH10BacTM感受態(tài)細胞冰上解凍。每個轉(zhuǎn)化試驗，輕輕地混合，將100ul高效DH10BacTM感受態(tài)細胞倒入預冷的15ml管子向細胞中加入適量的質(zhì)粒DNA，輕輕混合。千萬不要上下吹吸混合*pFastBacTM結(jié)構(gòu)：1ng(5ul)*pFastBacTM對照質(zhì)粒：1ng*pUC19對照：50pg（5ul）冰上撫育30分鐘42度熱激45秒立即冰上2分鐘加入900ul室溫的SOC培養(yǎng)基pFastBacTM轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)4小時。pUC19轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)1小時對于每個pFastBacTM的轉(zhuǎn)化：準備10折連續(xù)（不知道什么意思）用SOC稀釋的細胞（10-1，10-2，10-3），每個稀釋用100ul鋪一個LB平板，平板包含50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG。對于pUC19轉(zhuǎn)化：用SOC培養(yǎng)基1：100稀釋細胞，鋪100ul稀釋物在含有100ug/mlAmp的LB平板。10、37度撫育48小時。分析篩選的克隆（參見推薦）。注意：我們不推薦早于48小時挑單克隆，因為這樣可能會難于區(qū)分藍白斑。重要的：微型Tn7插入到微型attTn7附屬位點會干擾LacZa肽的表達，所以包含重組質(zhì)粒的克隆在藍色背景下是白色的，可能隱藏在未改變的質(zhì)粒中。選擇白斑分析。真正的白斑克隆比較大；因此為了避免選擇成假陽性，選擇最大的，最獨立的白斑。避免挑出現(xiàn)灰色的或者在中間的菌落，因為他們可能是包含空質(zhì)粒的細胞核重組細胞的混合。驗證顯性：1、挑10個白色的克隆，重新劃線在新鮮LB平板（50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG）。37度過夜培養(yǎng)。2、在包含Bluo-Gal和IPTG的重新劃線的平板上選出單克隆證明是白色的顯性，嫁接至有50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline的液體中3、使用我公司的試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA。選擇性的，你可以使用附錄提供的操作步驟。這個過程源于抽提大的質(zhì)粒DNA（＞100kb），適用于分離質(zhì)粒DNA。4、分析重組質(zhì)粒DNA證明成功轉(zhuǎn)化到了桿粒中。我們推薦使用PCR分析桿粒DNA。注意：適用瓊脂糖凝膠電泳可以證明轉(zhuǎn)化的成功與否，他可以分出高分子量的DNA。這個方法要比PCR分析可信度低，因為高分子量DNA是很難見到的。使用PCR分析重組質(zhì)粒介紹：重組桿粒DNA要大于135kb。既然限制性分析很難完成這么大的DNA分析，我們推薦使用PCR分析鑒定重組桿粒中的目的基因。桿粒包含M13正負引物位點，位于LacZa互不區(qū)域的微型attTn7位點兩側(cè)，可以完成PCR檢驗。本節(jié)提供使用M13引物的PCR檢驗指導。使用M13引物進行PCR分析：使用PCR法證明你的目的基因在重組桿粒中，你可能會：*使用M13Forward（-40）和M13Reverse引物*使用M13Forward（-40）或M13Reverse引物于你的插入片段雜交成聯(lián)合物DNA聚合酶：你可能會使用任何DNA聚合酶在你的PCR試驗中，包括PlatinumTaq酶。如果希望PCR產(chǎn)物＞4kb，我們推薦使用聚合酶混合物。例如高保真的PlatinumTaq酶得到PCR產(chǎn)物：使用下面過程擴增重組桿粒DNA，適用M13正反引物和PlatinumTaq酶。如果你使用M13F或M13R與一個你的基因特意引物混合，你需要自己決定擴增的條件。如果你使用其它的聚合酶，依照供應商提供的建議。注意：如果你的插入片段＞4kb擴增條件需要被優(yōu)化.每個樣品，在0.5ml微型管子中裝入50ul的量進行PCR反映重組桿粒DNA（100ng）1ul10*PCRBuffer5ul10mMdNTPMi*5ul50mMMgCl21.5ulPCR引物（1.25ul/10uM）2.5ul蒸餾水38.5總體積50ul一滴礦物油覆蓋一下參量進行擴增從反應產(chǎn)物吸取5-10ul進行瓊脂糖電泳分析你將會看到：如果轉(zhuǎn)化發(fā)生了，而且你使用的是M13正負引物擴增，你將會在電泳上看到下列PCR產(chǎn)物大小如果你使用的是M13和你的特異引物進行的擴增，你需要決定PCR產(chǎn)物是否是希望的。12頁的圖有助于你計算。重組桿狀病毒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染昆蟲細胞：介紹：一旦你證明了你的重組桿粒含有你的目的基因，就可以準備進行昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染了，以產(chǎn)生重組桿狀病毒。本章提供指導和建議以便完成昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染準備質(zhì)粒：你可以使用任何方法準備純化的重組桿粒DNA。桿粒DNA必須沒有酚和NaCl的污染，他們會殺死細胞，鹽類會干擾脂類復合物，降低轉(zhuǎn)染效率。我們推薦使用本公司產(chǎn)品提質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法：推薦使用一個陽離子脂質(zhì)體，例如Cellfectin試劑進行轉(zhuǎn)染。此試劑用來提供給表達系統(tǒng)使用。Cellfectin試劑：不做翻譯昆蟲細胞系：推薦使用Sf9和Sf21進行轉(zhuǎn)染。HighFive?andMimic?Sf9不推薦因為他們轉(zhuǎn)染效率低下。不過，如果你有了你的桿狀病毒株，你可以進行HighFive?andMimic?Sf9表達試驗。轉(zhuǎn)染介質(zhì)：為了高效的轉(zhuǎn)染，我們推薦在無Grace的昆蟲細胞培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染。注意Grace的昆蟲細胞培養(yǎng)基應該不含有FBS（血糖），因為蛋白在血糖和其補充物中會與Cellfectin試劑互作，影響轉(zhuǎn)染。注意：如果你在Sf-900ⅡSFM中收獲了Sf9或Sf21，你可以在不含有Grace的培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后可以容易的將Sf-900ⅡSFM轉(zhuǎn)變回去陽性對照：如果你有了從pFastBac對照質(zhì)粒中得到的重組桿粒，我們推薦，包括這個陽性對照在你的試驗中和轉(zhuǎn)化中能夠評估你的結(jié)果。在這些桿粒中，包括β-葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）將會在PH或者P10啟動子控制下表達。在轉(zhuǎn)染過后，表達的Gus和CAT可以適當進行驗證。所需材料：開始之前需要有下列材料：*從pFastBacTM結(jié)構(gòu)（500ng/ulTE溶解，PH8.0）中純化的重組桿粒DNA*從合適的pFastBacTM對照結(jié)構(gòu)中純化的重組桿粒DNA*合適培養(yǎng)基收獲的Sf9或者Sf21*Cellfectin試劑（4度保存）*Grace`s昆蟲細胞培養(yǎng)基，未被補充的（培養(yǎng)基不含有補充劑，F(xiàn)BS或者抗生素）*6孔培養(yǎng)板或者其它組織培養(yǎng)用具*12*75mm滅菌管*培養(yǎng)昆蟲細胞的完全培養(yǎng)基計算出你的轉(zhuǎn)染試驗所需的Sf9細胞數(shù)量，進行擴增。轉(zhuǎn)染前確定細胞健康且繁殖能力＞97%。轉(zhuǎn)染條件：我們通常使用下列條件在Sf9中擴增桿狀病毒株。對于你的轉(zhuǎn)染試驗這些條件應該作為一個起始點，你可以通過改變DNA和Cellfectin試劑的濃度以及細胞密度對條件進行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染步驟：適用下列步驟在6孔板進行Sf9細胞的轉(zhuǎn)染。如果你想在其它細胞培養(yǎng)用具中轉(zhuǎn)染細胞，你需要對你的條件進行優(yōu)化。記得使用無補充的Grace`s培養(yǎng)基，他不含有FBS或抗生素在6孔板或35mm組織培養(yǎng)板，與每個孔2ml含有抗生素的培養(yǎng)基中（例如：2ml的SF900ⅡSFM包含50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素）接種9*105Sf9細胞。27度細胞最少接觸1小時對于每個轉(zhuǎn)染的樣品，準備桿粒DNA：Cellfectin試劑混合在12*75mm的滅菌管中將1ug純化的桿粒DNA稀釋進入100ul未補充Grace培養(yǎng)基完全混勻Cellfectin試劑，翻轉(zhuǎn)混合5-10次。吸出6ulCellfectin試劑稀釋進100ul未補充Grace培養(yǎng)基。使用稀釋的Cellfectin試劑連接稀釋的桿粒DNA（總體積約210ul）。輕混合，室溫撫育15-45分鐘。在DNA/脂肪混合體撫育過程中，從細胞中除去培養(yǎng)基并用2ml未補充Grace培養(yǎng)基清洗。棄去清洗培養(yǎng)基。向每個含有混合體的管子中加入0.8ml未補充Grace培養(yǎng)基，清混勻，將混合體加入到含有細胞的孔中。27度培養(yǎng)5小時棄去DNA/脂肪混合體，向細胞中加入2ml全培養(yǎng)基（例如SF900SFM含有抗生素）27度潮濕條件撫育72小時或者指導你開始能夠看到病毒感染的現(xiàn)象。提取P1病毒株。分離P1病毒株介紹：帶有芽孢的病毒應該在轉(zhuǎn)染以后釋放入培養(yǎng)基72小時。但是，如果你的轉(zhuǎn)染效率不好，細胞可能在轉(zhuǎn)染后的4-5天也沒有被病毒感染的跡象。轉(zhuǎn)染過后的72小時，你需要親自檢查細胞是否有感染信號（下表）一旦細胞出現(xiàn)感染，使用下列步驟從培養(yǎng)基中收獲細胞。感染細胞的特性：使用倒差顯微鏡在250-400*觀察感染細胞時，可以看到病毒感染的細胞具有以下特點：感染記號顯性描述早期（第一個24小時）細胞直徑增加可以看到直徑增大了25-50%細胞核增大細胞核可能充滿細胞晚期（24-72小時）細胞停止增長與單個細胞相比，細胞不再增大出現(xiàn)顆粒體病毒芽孢信號，出現(xiàn)小泡分離細胞從平板或曲頸瓶脫離很晚期（大于72小時）細胞消亡細胞出現(xiàn)消亡，單層細胞開始出現(xiàn)消亡制備P1病毒株：1、一旦從第8步得到轉(zhuǎn)染細胞，上述的晚期轉(zhuǎn)染現(xiàn)象出現(xiàn)，就可以從每個孔中收集含有病毒的細胞，并轉(zhuǎn)入滅過菌的15ml帶蓋管子。500*g離心5分鐘除去細胞和大的碎片2、將上清轉(zhuǎn)到新的15ml離心管。這就是P1病毒株。4度避光儲存。儲存信息見下頁注意：如果你希望濃縮的病毒株，你可以在離心后，使用0.2um低蛋白吸附的濾器完成。病毒株的儲存：按下列條件儲存：避光，4度如果培養(yǎng)基不含血清，加入FBS至終濃度為2%，血清可以作為蛋白酶底物。對于長期保存，重新擴增后保存整株病毒于-80度不要在4度時儲存經(jīng)常使用的病毒。重復凍融會降低病毒的滴度。下一步：得到你的純化P1桿狀病毒株之后，你可以：擴增毒株（下節(jié)詳細介紹）這個過程推薦得到最高滴度的毒株，而且在你的試驗中優(yōu)化結(jié)果決定你的毒株的滴定度（見病毒斑點試驗）如果你希望，純化你的病毒結(jié)構(gòu)使用P1病毒株感染Sf9進行表達預試驗。注意：如果你想做一個小規(guī)模的或者是預試驗，你可以直接使用P1毒株感染Sf9進行表達試驗。由于毒株數(shù)量小，表達條件可能不能再生（如果滴度未知，MOI是不可知的）擴增你的病毒株介紹：P1毒株是小規(guī)模，低滴度的毒株，你需要使用這株去感染細胞，從而產(chǎn)生高滴度的P2株。轉(zhuǎn)染Sf9細胞得到的首株的滴度一般為1*106到1*107pfu/ml。用以下步驟擴增得到的P2株滴度為1*107到1*108pfu/ml。本章提供P2株的制備和指導所需材料：SF9或Sf21；P1病毒株；合適的培養(yǎng)用具；組織培養(yǎng)試劑；27度潮濕培養(yǎng)箱重要的：擴增P1病毒株，需要感染Sf9或者Sf21，使用懸浮或單層培養(yǎng)。根據(jù)你的需要，你可以任何規(guī)模的擴增，但是你因你使用的P1菌株的量受到限制。一般擴增P1在10ml懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2*106細胞/ml或在6孔板培養(yǎng)2*106細胞/ml。計算感染所需的Sf9細胞，隨后E*pand細胞。使用前確定你的細胞健康并且繁殖力大于97%多樣性感染（MOI）：為了擴增毒株，在多樣性感染細胞的圍是0.05-0.1。MOI就像每個細胞的病毒數(shù)量一樣需要定義。使用下列公式計算獲得特定的MOI需要多少病毒株：注意：如果你沒有滴定你的P1毒株，你需要假定滴度圍是1*106至107pfu/ml例如：需要感染10ml細胞，2*106細胞/ml，使用MOI=0.1我們假定P1毒株的滴度是5*106pfu/ml。擴增步驟：依照下列步驟在6孔板擴增P1毒株感染當天，準備Sf9和Sf21細胞上清和細胞板，2*106細胞/孔。接觸培養(yǎng)細胞室溫1小時1小時后倒差顯微鏡檢查細胞的吸附情況每孔加入合適數(shù)量的P1毒株27度潮濕培養(yǎng)箱撫育細胞48小時感染后48小時，從每個孔收集2ml含有病毒的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml的管子。500*g離心5分鐘棄去細胞和碎片。注意：可以在感染晚期收獲病毒（72小時）。每個桿狀病毒的結(jié)構(gòu)決定了優(yōu)化收獲時間。過度培養(yǎng)將會由于細胞的調(diào)亡使生殖能力衰減將上清轉(zhuǎn)到15ml管子。這是P2毒株。4度避光保存。長期保存需要整株在-80度檢測你的P2毒株的滴度梯度擴增步驟：一旦你有了高滴度的P2桿狀病毒毒株，你可以梯度增加擴增病毒至任何體積。為了產(chǎn)生高滴度的P3，梯度擴增的細胞量和病毒體積要適當，遵照本章指導從冰凍的主毒株獲得高滴度毒株：如果你儲存你的毒株在-80度，我們推薦使用此株產(chǎn)生另外的高滴度毒株進行表達試驗。當病毒在-80度保存時，滴度會降低。下面為指導和擴增過程病毒斑點試驗（PerformingaViralPlaqueAssy）:介紹：我們推薦使用斑點試驗進行：決定你毒株的滴度；斑點純化病毒（可選）試驗框架：決定病毒的滴度，你需要在6孔板的Sf9細胞準備10-flod連續(xù)稀釋的病毒株將不同稀釋的桿狀病毒加入到Sf9和感染細胞中1小時棄去病毒覆蓋細胞層使用Plaquing培養(yǎng)基撫育7-10天計算每個稀釋物中的斑點病毒滴度影響因素：影響滴度的因素很多：目的基因的大小。滴度一般會隨著目的基因的增大而減小轉(zhuǎn)染效率。為了高的轉(zhuǎn)染效率，我們推薦使用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染Sf9。準備DNA/脂質(zhì)體混合物在非補充Grace昆蟲培養(yǎng)基桿狀病毒株的年齡。長期保存在4度或者-80度病毒的滴度都會減弱。如果你的病毒株已經(jīng)保存了6個月-1年我們推薦在使用前滴度或者重新滴度病毒凍融次數(shù)。如果你儲存在-80度，每次凍融都會降低病毒10%的滴度錯誤的儲存方式。為了經(jīng)常使用，病毒株應該整株的保存在4度避光條件所需材料：實驗前所需材料：你的澄清的桿狀病毒株（使用前存在4度）適當培養(yǎng)基中的Sf9或Sf21（每個被滴度的桿狀病毒株為30ml對數(shù)期細胞，5*105細胞/ml）SF900ⅡSFM或其它合適的完全生長培養(yǎng)基Sf900培養(yǎng)基（1.3*）（100ml；或其它何時的培養(yǎng)基）4%瓊脂糖凝膠滅菌的細胞培養(yǎng)級別的蒸餾水100ml滅菌的玻璃瓶6孔子之培養(yǎng)板（每個毒株2個板用來滴定）無菌臺10、40度和70度水域11、微波爐（可選）12、27度潮濕培養(yǎng)箱注意：如果你在血清補充培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9（完全TNM-FN）。你需要有以下試劑Grace昆蟲培養(yǎng)基，補充過的Grace昆蟲培養(yǎng)基（2*）胎牛血清（FBS），高質(zhì)量的熱滅火的準備斑點培養(yǎng)基（PlaquingMedium）：斑點培養(yǎng)基由培養(yǎng)基和瓊脂糖混合組成，對于斑點試驗用來固定昆蟲細胞。在開始下列步驟前立即準備斑點培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)Sf9在SF900ⅡSFM中，那準備Sf900斑點培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)是在TNM-FH，準備Grace斑點培養(yǎng)基。注意其它培養(yǎng)基也可以使用在微波爐或者70度水域20-30分鐘溶化4%的瓊脂糖凝膠，溶化之后，下列物質(zhì)放入40度水域*空的，滅菌的100ml瓶子*Sf-900培養(yǎng)基（1.3*）或者Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基（2*）2、4%的瓊脂糖凝膠液化后，將膠，培養(yǎng)基和空瓶子轉(zhuǎn)到超凈臺3、用下列方法快速制備斑點培養(yǎng)基：Sf900斑點培養(yǎng)基：混合30ml的Sf-900培養(yǎng)基（1.3*）和10ml的4%的瓊脂糖凝膠在100ml瓶子里，輕搖。Grace`s斑點培養(yǎng)基：20ml熱滅活的FBS加入到100mlGrace昆蟲細胞培養(yǎng)基（2*）的瓶子。將25ml含有血清的Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基（2*）和12.5ml細胞培養(yǎng)級別的滅菌蒸餾水以及12.5ml溶化的瓊脂糖膠混合在100ml空瓶子，輕輕混勻使用之前將斑點培養(yǎng)基的瓶子放回40度水域斑點試驗的過程：使用以下步驟在6孔板完成斑點試驗以決定擬的桿狀病毒株的滴度。如果你有了桿狀病毒表達對照，我們推薦你對這個也作滴度。記得在試驗中做一個陰性對照（無病毒）注意：下列過程提供的量適合滴度一個病毒株（每個病毒株2個6孔板）。如果你想滴度更多，，相應的增加試劑量轉(zhuǎn)染當天，收獲Sf9，在Sf900ⅡSMF中制備30ml細胞上清，5*105細胞/ml。（或其它完全培養(yǎng)基）。如果你有陰性對照，你需要另外的一個板子是細胞在板底定居，蓋蓋室溫撫育1小時1小時培養(yǎng)之后，相差顯微鏡觀察細胞。Sf9應該是已經(jīng)吸附而且50%已經(jīng)融合。準備8個梯度稀釋（10-1到10-8）的純化病毒株，在Sf900ⅡSMF或者未補充的Grace培養(yǎng)基，無FBS。為了做這些，你需要在12ml管子順序稀釋0.5ml的病毒株或前面稀釋過的4.5ml培養(yǎng)基。需要完成8個管子。將裝有Sf9的6孔板和稀釋過病毒的管子轉(zhuǎn)移到超凈臺。標記上板子，需要2體積（一個樣品一個復制品）按如下方法：10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。從孔中除去培養(yǎng)基，立即用1ml適合的稀釋的病毒代替。室溫撫育1小時撫育1小時后，從40度水域中除去細胞和培養(yǎng)基瓶。從最高的稀釋到最低的稀釋（10-8至10-3）順序，從孔中除去含有病毒的培養(yǎng)基，使用2ml斑點培養(yǎng)基代替。盡快操作避免細胞單層干燥移動板子之前使用瓊脂糖培養(yǎng)基覆蓋10-20分鐘27度潮濕培養(yǎng)箱撫育7-10天之道斑點可見并可以計數(shù)。如果你想著色斑點計數(shù)，見下面，計算滴度，見前面注意：為了改進斑點的可見度，用中性紅染色平板。其它平板染料比如水晶藍不推薦，因為他們包含的有機溶劑能殺死宿主細胞。你可以使用下列之一：1、準備瓊脂糖溶液包含有中性紅，將溶液覆蓋感染后的板子子上4天。感染后7-10天計算板子數(shù)量。2、準備中性紅溶液加入到計數(shù)前1-2小時的平板（感染后7-10天）。重要的：如果你想斑點純化你的病毒，不要染色斑點使用中性紅，它可以誘導重組病毒的突變所需材料：開始試驗前你需要有下列物質(zhì)：1、中性紅2、細胞培養(yǎng)級別的蒸餾水3、Sf900ⅡSMF或其它培養(yǎng)基（如果制備瓊脂糖溶液）4、4%瓊脂糖凝膠（如果準備瓊脂糖溶液）5、40水域（如果制備瓊脂糖溶液）中性紅染色過程：準備瓊脂糖覆蓋的中性紅（第4天使用）在Sf900ⅡSMF（或其它全培養(yǎng)基）中制備1mg/ml的中性紅。過濾除菌。40度水域中50ml的管子混合下列試劑：1mg/ml的中性紅（1.5ml）；Sf900ⅡSMF（16.5ml）微波爐溶化4%的瓊脂糖凝膠，40度水域5分鐘將含有中性紅溶液的50ml管子和凝膠轉(zhuǎn)到超凈臺。加入6ml瓊脂糖凝膠到中性紅溶液每個孔用1ml中性紅覆蓋。瓊脂糖凝膠凝固后，將平板放回27度潮濕培養(yǎng)箱知道斑點可以計數(shù)。紅色單層中將會出現(xiàn)清楚地斑點準備中性紅染色（第7-10天計數(shù)前使用）準備1mg/ml的中性紅加入到細胞培養(yǎng)級別的蒸餾水每個孔加入0.5ml中性紅溶液，室溫撫育1-2小時用濾紙或吸耳球輕輕除去過量的燃料，計算斑點。在紅的背景下，透明膠上的斑點會清楚可見計算滴度：是用下列公式計算你的毒株的滴度。注意優(yōu)化圍是6孔板上每個孔計算3-20個斑滴度（pfu/ml）=斑的數(shù)量*稀釋因子*（1/接種體積ml/孔）例如：我們在每孔含有10-6病毒稀釋的孔中加入了1ml接種體積，得到了20個斑。使用公式得到滴度：滴度=20（斑）*106*（1/1ml/孔）=2*107pfu/ml你將會看到：當?shù)味葪U狀病毒株時，一般得到的滴度圍為：P1為1*106-1*107pfu/ml；P2為1*107-1*108pfu/ml。注意：如果你的P1毒株滴度小于為1*106pfu/ml或P2小于1*107pfu/ml，推薦生產(chǎn)新的毒株。斑點純化：你可以通過斑點純化從單個的病毒克隆得到毒株。使用下列步驟所需材料：Well-Space的病毒斑點的平板（來自斑點試驗）；活性大于95%的對數(shù)期的Sf9或Sf21；滅菌的巴斯德吸管和曲徑瓶過程：1、培養(yǎng)Sf9或者Sf21參照斑點試驗的1-3步使用巴斯德管和曲徑瓶，小心的選擇一個清澈斑點，將瓊脂糖蓋子（含有病毒）轉(zhuǎn)到1.5ml離心管，其中包含有500ul全培養(yǎng)基。使用漩渦震蕩混合均勻每個孔加入100ul瓊脂糖蓋子溶液27度潮濕培養(yǎng)箱撫育72小時從每個孔收集含有毒株的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml滅菌管。500*g離心5分鐘除去細胞和殘片將上清轉(zhuǎn)到新鮮的15ml管子。這個是斑點純化的毒株以后過程為擴增桿狀病毒株表達重組蛋白介紹：一旦你有了合適滴度的pFastBac桿狀病毒株，你可以感染昆蟲細胞進行重組蛋白試驗陽性對照：如果你有高滴度的pFastBac桿狀病毒對照結(jié)構(gòu)，你可能希望做一個你的試驗對照。一旦你的對照病毒感染了你的細胞，基因編碼的Gus和/或CAT將會限制表達，以便進行簡單的試驗。表達指導：下面提供了一個使用重組病毒感染昆蟲細胞表達目的蛋白的指導*細胞系：取決于你的需要和目的基因，你可以使用任何昆蟲細胞包括Sf9和Sf21或MimicTMSf9進行表達。細胞可以進行懸浮和貼壁培養(yǎng)。注意：你如果表達分泌蛋白，需要使用HighFive細胞改進表達*培養(yǎng)條件：一般在無血清條件下使用Sf900ⅡSMF或表達FiveSFM培養(yǎng)細胞。依據(jù)你的需要和目的蛋白，注意可能在感染后期需要添加0.1%-0.5%的FBS或BSA以便保護重組蛋白不被水解。Protien-Based蛋白酶抑制劑一般比人工合成的蛋白酶抑制劑便宜而且高效*感染條件：推薦在細胞處于中對數(shù)期時（密度為１Ｘ１０６－２Ｘ１０６細胞／ｍl）感染細胞。確定在感染時培養(yǎng)不受營養(yǎng)或環(huán)境限制*MOI：理想的MOI因細胞系間，相關(guān)感染動力學毒株或使用的克隆不同而不同。對于蛋白表達試驗，應該為每個毒株，介質(zhì)，反映和細胞系建立一個劑量反映，來證明感染參量的最優(yōu)。最為試驗的起始，感染細胞使用的MOI為1-5*時間進程：推薦實施一個時間進程決定表達蛋白的表達動力學，因為許多蛋白可能會在培養(yǎng)之中被細胞蛋白酶降解。注意：分泌蛋白的最大表達一般在感染30-72小時看到，非分泌表達蛋白48-96小時。最優(yōu)的表達：大量因素影響著最優(yōu)表達，包括細胞系，MOI，你的目的，基因種類等。你可以使用下列優(yōu)化的條件表達你的重組蛋白*細胞系：一定量MOI的感染的Sf9，Sf21，HighFive或MimicTMSf9。重組蛋白表達的試驗在不同的感染后時間（24，48，72，96小時）。選擇細胞系提供重組蛋白的最好表達條件*MOI：不同的MOIs的感染的細胞量和蛋白試驗。使用重組蛋白的最優(yōu)水平提供的MOI*時間進程：固定的MOI感染的細胞和試驗在感染后不同時間表達重組蛋白（24，48，96）選擇最優(yōu)條件分析重組蛋白表達：是用下列過程分析你的重組蛋白。下列過程使用與24孔形式的感染后24-96小時收獲的細胞進行分析。其它程序也可以參考1、24孔板接種Sf96*105/孔.細胞接觸至少30分鐘2、棄去培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基清洗一次。換上300ul新鮮培養(yǎng)基3、在希望的MOI值時每孔加入毒株。包括合適的對照4、27度潮濕培養(yǎng)5、合適的時間收獲細胞或培養(yǎng)基（分泌表達）（感染后24，48，72，96）。如果收獲細胞，棄去培養(yǎng)基，使用無血清培養(yǎng)漂洗一次。1*SDSBuffer400ul溶解細胞6、-20度冷凍或煮沸樣品最少3分鐘，使用SDS分離蛋白重組蛋白的檢測：可以使用任何方法，包括目的蛋白功能性檢驗和Western印記。如果你做WB，需要有你目的蛋白的抗體。注意：如果你使用的是pFastBacTMHT表達蛋白，N末端的6*His標簽和TEV識別位點將會增加你的目的蛋白約3KDβ-葡糖甘酸酶試驗：如果你的試驗中包括了pFastBacTM1Gus或者pFastBacTMDual-Gus/CAT結(jié)構(gòu)，你需要使用下列方法進行β-葡糖甘酸酶試驗。其他方法也可用：*使用*-葡糖甘酸在瓊脂糖板上檢驗籃斑*定性的快速鑒定β-葡糖甘酸酶，使用*-葡糖甘酸混合小量的細胞觀察它的藍色。簡單的，混合5ul20mg/ml的*-葡糖甘酸（溶于DMSO或二甲基甲酰胺）到50ul細胞培養(yǎng)基。2小時觀察藍色的變化CAT蛋白試驗：如果你的試驗中包括了pFastBacTMHT-CAT或者pFastBacTMDual-Gus/CAT結(jié)構(gòu)，你需要使用你選擇的方法進行CAT表達試驗。CAT試驗有顯影試劑盒，如果做WB，可以從公司買抗血清純化重組蛋白：你可以使用任何方法純化蛋白。注意：涂過你的目的基因在pFastBacTMHT的6*His標簽筐，你可以使用親和層析介質(zhì)例如ProBond或Ni-NTA。使用TEV蛋白酶除去N末端融合標簽：如果你使用pFastBacTMHT表達融合蛋白，你可以使用TEV蛋白酶除去N末端融合的標簽。注意：由于你可隆重使用的限制酶，增加得AA可能會出現(xiàn)在你的蛋白N末端問題解決克隆進入pFastBacTM載體：問題原因解決重組pFastBacTM結(jié)構(gòu)物插入片斷pFastBacTM質(zhì)粒或插入DNA消化不完全*是用另外的限制酶消化*純化插入片斷pFastBacTM質(zhì)粒遭到不完全的或者過渡的磷酸酯酶消化根據(jù)你使用的磷酸酯酶的說明書優(yōu)化去磷酸化的條件pFastBacTM質(zhì)?；虿迦隓NA片斷未純化好使用試劑盒連接不完全*根據(jù)你使用的連接酶說明書進行連接插入了不穩(wěn)定的DNA序列如LTR和反向重復序列*低溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞（30度）*使用MA*高效Stbl2完全細胞用于轉(zhuǎn)化。Stbl2Ecoli轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定片斷設計轉(zhuǎn)化后沒有得到克隆或很少Ecoli感受態(tài)細胞效率低下*如果存儲不當，制備新的細胞*使用我公司的感受態(tài)DNA不純純化插入的DNA。確信沒有苯，蛋白質(zhì)，去污劑和乙醇轉(zhuǎn)化DNA量太大*對于化學的感受態(tài)細胞加1-10ng的DNA入5ul或少于100ul。電轉(zhuǎn)感受態(tài)為10-50ng入1ul或少于20ul細胞連接不完全*優(yōu)化連接反應*進行連接對照，進行膠檢驗注意：連接產(chǎn)物和線性DNA轉(zhuǎn)化效率要比超螺旋DNA低10*，100-100*連接反應含有感受態(tài)細胞抑制劑減少連接反應的量。轉(zhuǎn)化前使用5*TE稀釋抗生素*確定抗生素使用正確，濃度正確*減產(chǎn)抗生素是否降解。使用新的感受態(tài)細胞儲存不當-80度儲存感受態(tài)細胞處理不當冰上融化后立即使用，不要震蕩轉(zhuǎn)化過程細胞未熱激或撫育不當根據(jù)說明書進行產(chǎn)生重組桿粒DNA：當轉(zhuǎn)化到DH10Bac時你可能會遇到下列情況，及解決方法問題原因解決無藍斑（無重組）克隆注意：可能你看到的并挑選的藍斑沒有重組桿粒著色時不夠至少48小時在確定克隆顯性之前使用*-Gal代替Bluo-GalBluo-Gal在篩選中增加了藍白斑的對照轉(zhuǎn)化后成長不夠涂板之前轉(zhuǎn)化細胞在SOC至少培養(yǎng)4小時平板沒有Bluo-Gal和IPTG制備新鮮的選擇平板，包含50Kan，7Gen，10TeTra，100Bluo-Gal，40IPTG板上克隆太多*梯度稀釋轉(zhuǎn)化混合物，涂板均勻*調(diào)整細胞稀釋度（10-2到10-4）平板時間太長或見光儲存*不要使用超過4周的平板*避光保存撫育時間太短或溫度太低條克隆前撫育至少48小時，37度撫育所有克隆都是藍色pFastBacTMDNA質(zhì)量不好*使用純化質(zhì)粒DNA*檢查質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，確定DNA沒有降解平板未加Gen（慶大霉素）制備新鮮的選擇平板，包含50Kan，7Gen，10TeTra，100Bluo-Gal，40IPTG得到克隆很少復表達時使用LB培養(yǎng)基使用SOC培養(yǎng)4小時復表達時間太短增加復時間37度4小時或30度6小時藍白斑難以區(qū)別瓊脂PH不對將LB瓊脂調(diào)節(jié)至7.0藍斑亮度太弱*使用Bluo-Gal*增加Bluo-Gal的濃度至300ug/ml*使用黑白背景分辨平板板上克隆太多或者太少調(diào)整稀釋細胞濃度至理想撫育時間太短或溫度太低鋪板48小時在挑斑*37度撫育IPTG濃度不對優(yōu)化IPTG濃度，20-60ug/ml一般會使顏色清晰。分離桿粒DNA：問題原因解決桿粒DNA降解DNA儲存不當純化的桿粒DNA-20度*不要經(jīng)常凍融高分子兩桿粒DNA處理不當*分離桿粒DNA時，不要震蕩DNA溶液*不要機械的重旋DNA，讓溶液溫和的降到管低產(chǎn)量低抗生素濃度不正確轉(zhuǎn)化的DH10Bac細胞生長在含有50ug./mlKan，7Gen