組織免疫熒光

免疫染色試驗(yàn)方法和步驟免疫染色(immunolstaining)包括免疫熒光(immunolfluorescence)、免疫組化(immunolhistochemistry)、免疫細(xì)胞化學(xué)(immunolcytochemistry)等，可以參考如下步驟進(jìn)展操作。樣品預(yù)備(Samplepreparation)對(duì)于貼壁細(xì)胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培育細(xì)胞，然后到預(yù)定時(shí)間時(shí)進(jìn)展固定等后續(xù)操作。也可以用干凈的蓋玻片，70%6孔板內(nèi)，然后用無(wú)菌的生理鹽水、PBS或培育液洗去殘留的乙醇。這時(shí)就可以種入細(xì)胞進(jìn)展培育，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，即可進(jìn)展固定等后續(xù)操作。對(duì)于懸浮細(xì)胞：把細(xì)胞先在固定液中固定，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，枯燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。然后就可以進(jìn)展后續(xù)操作。假設(shè)細(xì)胞的粘附力氣不佳，可以在載玻片上用PDL等物質(zhì)進(jìn)展處理，以增加載玻片的粘附力氣。對(duì)于冷凍切片：對(duì)于石蠟切片：脫蠟：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用穎的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無(wú)水乙醇5分鐘，90%5分鐘，兩次，7055分鐘，兩次。30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。固定免疫染色固定液(P0098)。固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(P0106)5分鐘。封閉(Blocking)免疫染色封閉液(P0102)604℃封閉過(guò)夜。從封閉開(kāi)頭全部的步驟，確定要留意樣品的保濕，避開(kāi)樣品的枯燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。側(cè)擺搖床(ESHK02)，側(cè)向搖擺速度比較緩慢，而且也簡(jiǎn)潔讓溶液掩蓋樣品。假設(shè)樣品比較簡(jiǎn)潔脫落，也可以把全部的步驟放置在桌面上靜止進(jìn)展，即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動(dòng)，但靜止操作時(shí)宜適當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間或次數(shù)。一抗孵育(Primaryantibodyincubation)參考一抗的說(shuō)明書(shū)，依據(jù)適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。4℃在側(cè)擺搖床上緩4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。5分鐘。吸盡洗滌液后，再參與洗滌液，53次。假設(shè)結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)(P0108)稀釋熒光標(biāo)記的二抗，或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液(P0110)稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標(biāo)記的二抗。辣根過(guò)氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天訂購(gòu)。用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，馬上參與稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。5分鐘。吸盡洗滌液后，再參與洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。假設(shè)結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。蛋白檢測(cè)(Detectionofproteins)對(duì)于免疫熒光染色，此時(shí)已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀看。對(duì)于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當(dāng)?shù)娘@色底物，或AB檢測(cè)體系等進(jìn)展后續(xù)檢測(cè)。多重染色(Multiplestaining)DAB多重?zé)晒馊旧好庖邿晒馊旧噭┖?Cy3(P0193)進(jìn)展紅色熒光染色，隨后可以用免疫熒光染色試劑盒-FITC(P0186)進(jìn)展綠色熒光染色，在完成上述兩Hoechst染色試劑盒(C0003)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)展染色，染色后為藍(lán)色熒光。HE染色進(jìn)展復(fù)染：免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)進(jìn)展HE染色。免疫熒光染色步驟ImmunofluorescenceMethodFrozenSectionsSnapfrozenfreshtissuesinliquidnitrogenorisopentanepre-cooledinliquidnitrogen,embeddedinOCTcompoundincryomolds.Storefrozenblocksat80oC.Cut4-8umthickcryostatsectionsandmountonsuperfrostplusslidesorgelatincoatedslides.Storeslidesat-80oCuntilneeded.Beforestaining,warmslidesatroomtemperaturefor30minutesandfixinicecoldacetonefor5minutes.Airdryfor30minutes.WashinPBSParaffinSectionsProcedureforImmunofluorescenceStainingRinseSectionsinwashingbufferfor2x2min.PrimaryAntibody(沒(méi)有標(biāo)記一抗):incubatesectionsinprimaryantibodyatappropriatedilutioninprimaryantibodydilutionbufferfor1houratroomtemperatureorovernight.Note onotrinsesectionsbetweenserumblockandprimaryantibodyincubation.Rinseinwashingbufferfor3x2min.4 SecondaryAntibody:incubatesectionsinbiotinylatedsecondaryantibody(生物素標(biāo)記的二抗)(1:500,VectorLabs)insecondaryantibodydilutionbufferfor30minutesatroomtemperature.Rinseinwashingbufferfor3x2min.Detection:incubatesectionsinFITC-AvidinD(1:500,VectorLabs)inPBSfor30minutesatroomtemperature.Protectingslidesfromlightstartingfromthissteptotheendbycoveringslideswithaluminumfoilorblackbox.Rinseinwashingbufferfor3x2min.CounterstainwithPIorDAPIifdesiredfor20-30minutesatroomtemperature.Rinseinwashingbufferfor3x2min.CoverslipwithVectoraqueousAnti-fadefluorescentmountingmediumandsealwithnailpolish.Storeslidesindarkat4oC.1、載玻片的處理：ZLI-9001APESZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)展處理。具體方法如下：APES1:50APES20~30APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)留意組織要一步到位，并盡量削減氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。HistogripTM1:50Histogrip1~260C60C2、常用酶消化：0.05%~0.137℃、10~40示。0.437℃、30~180如：Laminin〔層粘蛋白〕，CollagenIV〔IV〕等。g/mlsaponin302.3皂素〔Saponin〕：2~103、抗原熱修復(fù)：可依據(jù)試驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但試驗(yàn)證明，以0.01M〔pH6.0〕效果ZLI-9064枸櫞酸鹽緩沖液〔粉劑〕1000mlpH6.00.1，pH3％HO22

102×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液〔工作液〕的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~9滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求〕10~20〔留意：不行將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型〕。PBS1500ml~3000ml〔工作液〕注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)〕，1~2后，取下氣閥，翻開(kāi)鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS2×3，下接免疫組化染色步驟。石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液〔工作液〕的容92℃~920~30，PBS染色步驟。4、免疫組化染色步驟：〔ZYMEDSP〕石蠟切片脫蠟至水。3%HO22

室溫孵育5~10分鐘，以消退內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。，PBS5〕10一抗或一抗工作液，37℃1~24℃過(guò)夜。PBS，5×3滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗〔1%BSA-PBS〕，37℃孵育10~30素標(biāo)記二抗工作液，37℃10~30PBS，5×3滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素〔PBS〕，37℃孵育10~30記鏈霉卵白素工作液，37℃10~30PBS，5×3顯色劑顯色〔DABAEC〕。自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片。冰凍切片免疫組化染色步驟4℃10PBS，5×33％過(guò)氧化氫孵PBS，5×2。下接免疫組化染色操作步驟。細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)-間接免疫熒光法離子去污劑進(jìn)展透化處理?！静僮鞣椒ā咳∫压潭ê玫募?xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組織切片〔石蠟或冰凍切片〕；0.2%TritonX-100或NP-40的PBS2min〔室溫〕，有些標(biāo)本可能需要長(zhǎng)15min，時(shí)間視抗原而定；“細(xì)胞外表抗原的檢測(cè)-間接免疫熒光法”步驟〔2〕；【留意事項(xiàng)】在使用前，一抗二抗均應(yīng)測(cè)試其適宜的稀釋度。的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使交聯(lián)構(gòu)造解體。因此，應(yīng)避開(kāi)固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。信號(hào)微弱的解決方法：①提高一抗和二抗的濃度以增加敏感性，這必需測(cè)試各種濃度抗體的滴度；20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點(diǎn)中，應(yīng)摸索出一個(gè)最正確條件以產(chǎn)生有效信號(hào)且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗(yàn)，由于每組抗體和抗原的狀況會(huì)有所不同；③轉(zhuǎn)變檢測(cè)方法，用共聚焦顯微鏡觀看，可提高敏感性。背景不好的解決方法細(xì)胞樣本進(jìn)展熒光染色時(shí)，背景問(wèn)題主要來(lái)自兩個(gè)方面，即非特異性染色和特異性穿插反響。互作用而發(fā)生吸附，而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。100，000′g30min以去除蛋白聚合物。*滴定一抗和所用的檢測(cè)試劑，以確定能夠產(chǎn)生適宜信號(hào)的最低濃度。*固定后，用飽和量并不被檢測(cè)試劑結(jié)合的非特異性抗體封閉樣品，有效的封閉液包括5%的與標(biāo)記二抗3%BSA3%的脫脂奶粉。*用上述封閉液稀釋抗體和檢測(cè)試劑。2%吐溫-20。*縮短一抗或標(biāo)記試劑的孵育時(shí)間。*充分洗滌〔延長(zhǎng)洗滌時(shí)間，重復(fù)次數(shù)〕。*轉(zhuǎn)變檢測(cè)方法。Ig結(jié)合的蛋白質(zhì)。*如用多克隆抗體，應(yīng)滴定抗體〔假陽(yáng)性〕。*如用多克隆抗體，親和純化特異性抗體〔假陽(yáng)性〕。*如用多克隆抗體，用適當(dāng)?shù)谋闻K粉吸取以阻抑假陽(yáng)性。*換用其他抗體〔穿插反響及假陽(yáng)性〕。細(xì)胞外表抗原的檢測(cè)-間接免疫熒光法【試劑】一抗和熒光標(biāo)記的二抗固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。洗滌液及抗體稀釋液(pH7.4PBS-Tween20)【操作方法】取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組織切片〔石蠟或冰凍切片〕；25ml60min；留意不行使蓋玻片接觸培育板孔邊緣。每個(gè)檢檢測(cè)二抗染色的背景；假設(shè)可能，用陽(yáng)性樣品作為陽(yáng)性比照組?！捕埂?5ml20min；標(biāo)記二抗在使用前，應(yīng)預(yù)試其適宜的稀釋度；35min；〔50ml〕。用一尖頭鑷子將蓋玻片取出。將蓋玻片30min；在熒光顯微鏡下觀看、拍照。經(jīng)典的熒光抗體技術(shù)根本原理直接法〔待檢抗原標(biāo)本〕結(jié)合，來(lái)鑒定未知抗原。其優(yōu)點(diǎn)為：①由于在反響中只有兩種因子參與，結(jié)果推斷較簡(jiǎn)潔；②特異性強(qiáng)，與其他抗原穿插染色較少；其缺點(diǎn)有；①敏感性較差；②一種標(biāo)記抗體只能鑒定一種抗原；③不能用于鑒定未知抗體。間接法〔第一抗體〕與待檢抗原反響或用未知抗體與〔二抗〕反響。在第一步〔二抗〕必定與抗體進(jìn)展鑒定。其優(yōu)點(diǎn)為；5-10倍；②用一種標(biāo)記的抗體，就能與一種以上的相應(yīng)的抗體或抗原協(xié)作鑒定多種未知的抗原或抗體；其缺點(diǎn)有①在反響中有多種因子參與，簡(jiǎn)潔產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果推斷有時(shí)較困難；②操作步驟多，費(fèi)時(shí)。雙標(biāo)記法雙標(biāo)記法是用兩種熒光素〔常用FITCPE〕分別標(biāo)記特異性不同的抗體，用于檢測(cè)同一標(biāo)本中的不同抗原。此法常用于細(xì)胞外表抗原和受體的爭(zhēng)論。熒光抗體的質(zhì)量鑒定與保存熒光抗體的質(zhì)量通常用抗體效價(jià)和結(jié)合比率〔F/P比值〕來(lái)表示。1:16-1:32呈陽(yáng)性者較為抱負(fù)。2、熒光素〔F〕與蛋白質(zhì)〔P〕結(jié)合比率〔F/P比值〕法1-2〔抗TRITC，F(xiàn)/P比2.1-9.4之間均可用，但以數(shù)值較低者為佳?！驹噭俊?〕0.01mol/LpH7.2 PBS〔2〕牛血清白蛋白〔BSA〕〔3〕0.025mol/LpH9.0CB【方法】〔1〕將FITC用少量CB溶解后，再用0.01mol/LpH7.2 稀釋至100ml，作為原液；〔2〕用PBS0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0……10.0mg/ml490nm測(cè)定吸光度；將BSA0.01mol/LpH7.2PBS0.1、0.2、0.3……1.5mg/ml，280nm測(cè)定吸光度；含量〔mg/ml〕，F(xiàn)ITC和BSA蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；質(zhì)量；F/P比值：OD495nmF/P比值=2.87×────────────OD280nm-0.35×OD495nmOD515nmF/P比值= ─────