基因工程概論2

（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶ⅠT4DNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶-------“縫紉針”

--------“基因剪刀”重組DNA技術(shù)中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶---“基因剪刀”定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口bluntend粘端切口stickyend同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶（三）目的基因（targetDNA）－“乘客”

cDNA(complementaryDNA)反轉(zhuǎn)錄合成，與mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA基因組DNA(genomicDNA)一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列（四）基因載體—“交通工具汽車”定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)（MCS）；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質(zhì)粒

(plasmid)質(zhì)粒：存在于細(xì)菌染色體之外的能獨(dú)立自主復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA分子。帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀目錄ori含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因的N端）M13mp系列pUC系列3.粘性質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了λ噬菌體的cos基因。能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。小分子多肽基因2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）1*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫2*從基因組DNA文庫獲取目的基因cDNA文庫(cDNAlibrary)：

以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA）再復(fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。3*從cDNA文庫獲取目的基因DNA文庫目錄Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎

PCR(Polymerasechainreaction)

是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)目的:

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系及基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

一、基本工作原理Cycle1Cycle2基本工作原理Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。Cycle3（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)n