應(yīng)激性潰瘍中樞調(diào)節(jié)機制及其與腎上腺皮質(zhì)軸間關(guān)系的研究

應(yīng)激性潰瘍中樞調(diào)節(jié)機制及其與腎上腺皮質(zhì)軸間關(guān)系的研究

應(yīng)激（su）是一種急性疾病，以胃粘膜糜爛或淺表性潰瘍?yōu)樘卣?。在?yán)重的情況下，可以發(fā)生胃腸道穿孔和出血。這是嚴(yán)重疾病的常見并發(fā)癥。目前治療主要采用抑酸藥、抗酸藥、黏膜保護(hù)劑等,缺乏綜合防治的方法。左金丸源自《丹溪心法》,經(jīng)臨床與實驗證明它是防治SU的有效名方。本實驗中采用改良束縛浸水法制作應(yīng)激性潰瘍動物模型,探討SU的中樞調(diào)節(jié)機制及其與丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸系統(tǒng)之間的關(guān)系,并觀察左金丸的預(yù)防作用。1模型制備、檢測1.1實驗動物分組及模型制備:選用體質(zhì)量180~220g的健康雄性Wistar大鼠(購自本校實驗動物中心,動物合格證號:粵檢證字2002A041號),室溫22~26℃安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。隨機將動物分為6組:正常對照組,應(yīng)激模型組,左金丸高、中、低劑量組,陽性藥物(雷尼替丁)對照組。將實驗大鼠禁食24h后,晚0時放入自制大鼠固定器內(nèi),調(diào)整體位以使其不產(chǎn)生強烈反抗為宜。浸入溫度約26℃的水中,水面達(dá)劍突處,至6時取出,SU模型即制備完畢。1.2給藥方法:左金丸由黃連和吳茱萸組成,低劑量組黃連1.8g/kg,吳茱萸0.3g/kg;高劑量組×4倍劑量,中劑量組×2倍劑量。由第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院中藥房提供,常規(guī)煎煮取汁,濃縮,高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。雷尼替?汕頭金石制藥廠)為312.5g/kg。各藥物按比例配制成水溶液,用2ml灌胃;正常組和模型組以2ml生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥3d,第3d給藥2h后按上述方法制作模型。1.3檢測指標(biāo)及方法1.3.1胃潰瘍指數(shù)(IU)、胃液pH值:大鼠經(jīng)腹腔麻醉,結(jié)扎幽門,取出胃。由賁門吸取少量胃液,用試紙(購自上海三愛思試劑有限公司,批號20020710)測定pH值。向胃內(nèi)注入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液10ml,固定30min后沿大彎剪開、展平,測量潰瘍個數(shù)和長度,參照Guth法計算IU及潰瘍抑制百分率(胃黏膜損傷面積長徑<1mm計1分,1~2mm計2分,2~3mm計3分,3~4mm計4分,>4mm即分段測量,全胃得分總和為IU)。1.3.2免疫組化法檢測下丘腦室旁核c-fos:從腹主動脈取血后結(jié)扎之,經(jīng)左心室至升主動脈插管,先灌注生理鹽水200ml,再灌注含4%多聚甲醛溶液500ml。立即取腦后固定于4%多聚甲醛溶液中4~6h,再移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖磷酸緩沖液中至腦組織塊沉底,次日恒冷冠狀連續(xù)切片,切片厚30μm,取含下丘腦室旁核斷面的切片,黏附于經(jīng)多聚賴氨酸(APES)處理的載玻片上。鏈霉卵白素(SP)法檢測c-fos:c-fos免疫組化試劑盒購自北京中山公司。正常羊血清室溫封閉20min,兔抗c-fos抗體(1∶100)4℃孵育12h,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗;生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(即用型)37℃孵育20min,0.01mol/L的PBS漂洗;辣根過氧化物酶抗標(biāo)記鏈霉卵白素復(fù)合物(S-A/HRP,即用型)37℃孵育20min,漂洗后用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑呈色。脫水、透明和封片后,奧林巴斯光鏡下觀察并進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。陰性對照以PBS代替一抗。1.3.3原位雜交法檢測下丘腦室旁核促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素mRNA(CRHmRNA):取含下丘腦的室旁核斷面切片,經(jīng)漂洗、消化后,予地高辛標(biāo)記的CRHcDNA探針42℃反應(yīng)24h,探針濃度為0.5mg/L;梯度系列標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽-氯化鈉(SSC)漂洗后,加入堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛抗體,1∶1000稀釋,室溫反應(yīng)4h;DAB顯色;脫水、透明和封片后,奧林巴斯光鏡下觀察并進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。陰性對照以不含探針的雜交液雜交。CRHmRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司。1.3.4放射免疫方法檢測血漿皮質(zhì)醇(CORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH):腹主動脈取血,抗凝離心制備血漿,-20℃凍存,操作按照放射免疫試劑盒(均購自美國DSL公司)說明書要求進(jìn)行。1.4統(tǒng)計學(xué)處理:實驗結(jié)果用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析,兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗,顯著性水平為P<0.05。2結(jié)果2.1左金丸對su大鼠胃粘膜的影響2.1.1組織病理學(xué)檢測①正常組:剖開胃壁后見胃黏膜光整完好。②模型組:打開腹腔可見胃腸脹氣,漿膜層充血水腫;剖開胃壁可見胃內(nèi)少量淡咖啡色物質(zhì),黏膜充血、水腫、糜爛,多處點狀或線狀出血點和潰瘍(以胃體和幽門處多見)。③左金丸組:高、中劑量組胃黏膜表面光滑,僅見散在少量點狀出血點,未見其他改變;低劑量組輕度充血水腫,尚存在線狀出血點或較小潰瘍。④雷尼替丁組:變化類似左金丸高劑量組,僅見少量出血點。2.1.2各組療效的相關(guān)性模型組IU明顯高于正常組(P<0.01)。左金丸各劑量組均可減少潰瘍的發(fā)生率(P均<0.01),而且呈明顯的正相關(guān);其中尤以高劑量組的療效為佳,接近正常組水平(P>0.05)。雷尼替丁組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01);而左金丸高劑量組與雷尼替丁組無顯著性差異(P>0.05)。2.1.3對血清中苯甲酸免疫指標(biāo)的影響模型組胃液pH值明顯低于正常組(P<0.01)。左金丸各劑量組均可抑制胃酸分泌(P均<0.01),但未呈劑量依賴性;其中,高劑量組的療效為佳,接近正常組水平(P>0.05)。雷尼替丁組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01);而左金丸高劑量組與雷尼替丁組無顯著性差異(P>0.05)。2.2左金丸對小鼠腦室旁核c-fos蛋白表達(dá)的影響光鏡下觀察,c-fos蛋白免疫陽性物質(zhì)呈棕黃色,位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)。正常組僅在下丘腦室旁核、邊緣系統(tǒng)的前扣帶回、腦干的藍(lán)斑見到少量淡染的陽性細(xì)胞。模型組陽性細(xì)胞明顯增多、著色加深,以下丘腦室旁核最為密集,主要位于小細(xì)胞區(qū);下丘腦視上核、內(nèi)側(cè)視前區(qū)以及丘腦室旁核、杏仁核、藍(lán)斑、孤束核、中縫背核、皮質(zhì)等部位均不同程度有較強的c-fos蛋白表達(dá),但弱于下丘腦室旁核。光鏡下(×400倍)計數(shù)5個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并取平均值,模型組下丘腦室旁核內(nèi)c-fos陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組(P<0.01)。左金丸高劑量組可減少下丘腦室旁核內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá),與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。其他各給藥組與模型組比較均無顯著性差異(P均>0.05)。2.3左金丸對杏仁骨髓內(nèi)crhmrna表達(dá)的影響光鏡下觀察,CRHmRNA呈大量棕黃色顆粒,聚集在細(xì)胞核周圍的胞漿內(nèi)。正常組僅在下丘腦室旁核見到極少量淡染的陽性細(xì)胞。模型組陽性細(xì)胞明顯增多、著色加深,主要分布在下丘腦室旁核小細(xì)胞部,以雙極或梭形細(xì)胞為主;杏仁核的部分區(qū)域也存在CRHmRNA陽性細(xì)胞。光鏡下(×400倍)計數(shù)5個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并取平均值,模型組下丘腦室旁核內(nèi)CRHmRNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組(P<0.01)。左金丸高、中劑量組可減少下丘腦室旁核內(nèi)CRHmRNA的表達(dá),與模型組比較均有顯著性差異(P均<0.05)。左金丸低劑量組、雷尼替丁組與模型組比較均無顯著性差異(P均>0.05)。2.4左金丸對雷尼替丁血漿cort的影響模型組血漿ACTH明顯高于正常組(P<0.01)。左金丸高、中劑量組可降低ACTH(P均<0.05),其中高劑量組的療效為佳,接近正常組水平(P>0.05)。雷尼替丁組與模型組無顯著性差異(P>0.05)。模型組血漿CORT明顯高于正常組(P<0.01)。左金丸各劑量組均可降低CORT(P均<0.01),其中以高劑量組的療效為佳,接近正常組水平(P>0.05)。雷尼替丁組與左金丸各劑量組比較均無顯著性差異(P均>0.05),與模型組比較也無顯著性差異(P>0.05)。P<0.05,△△P<0.012.5血漿acth、cort的與血漿acth、cort的相關(guān)性表4下丘腦室旁核內(nèi)c-fos與CRHmRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.737,P<0.01)。血漿ACTH及CORT的升高與胃液pH值均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r1=-0.493,P<0.05;r2=-0.592,P<0.01)。模型組IU與胃液pH呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.710,P<0.01)。3討論3.1模型大鼠c-fos蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)SU為危重疾病的并發(fā)癥,其發(fā)病機制十分復(fù)雜,治療尚缺乏有效措施。目前研究多限于胃黏膜局部神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)方面,對應(yīng)激系統(tǒng)的啟動因素和中樞調(diào)節(jié)機制尚缺乏研究。c-fos蛋白作為第三信使,盡管其作用具有多效性和非特異性,但它作為神經(jīng)元被激活的標(biāo)志,可有效地用于神經(jīng)通路追蹤和信使傳遞途徑的研究。由于c-fos蛋白表達(dá)易受非實驗因素的干擾,本實驗做到所有實驗動物的束縛應(yīng)激和灌注都在相同的時間段內(nèi)進(jìn)行,避免了生物節(jié)律的影響;操作特別輕柔,避免不必要的刺激。結(jié)果顯示,模型組c-fos蛋白在下丘腦室旁核區(qū)有強烈表達(dá),與正常組有顯著性差異。下丘腦室旁核中的陽性神經(jīng)元主要位于小細(xì)胞區(qū),此區(qū)富含CRH,與HPA軸關(guān)系密切,提示室旁核在應(yīng)激反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。既往有人損毀室旁核導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)基本消失,充分說明c-fos表達(dá)和神經(jīng)元功能變化間的直接關(guān)系。同時觀察到下丘腦視上核、內(nèi)側(cè)視前區(qū)以及丘腦室旁核、杏仁核、藍(lán)斑、孤束核、中縫背核、皮質(zhì)等部位均有不同程度的c-fos蛋白表達(dá)增強,表明這些核團(tuán)也廣泛參與了SU的神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)。CRH是誘導(dǎo)ACTH、β-內(nèi)啡肽和其他阿片黑色皮質(zhì)素原(POMC)源性肽從垂體前葉釋放的主要生理調(diào)節(jié)因子。在應(yīng)激源影響下,下丘腦室旁核釋放的CRH啟動HPA軸,調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。本研究的結(jié)果顯示,SU模型組大鼠下丘腦室旁核內(nèi)CRHmRNA陽性細(xì)胞明顯增多、免疫反應(yīng)染色增強,與正常對照組比較有顯著性差異,提示應(yīng)激過程中室旁核內(nèi)合成大量CRH以適應(yīng)機體調(diào)節(jié)的需要;同時杏仁核的部分區(qū)域也存在CRHmRNA陽性細(xì)胞,說明杏仁核也有可能分泌CRH直接作用于HPA軸,與下丘腦共同構(gòu)成SU中樞調(diào)節(jié)的神經(jīng)環(huán)路。此外,SU模型組大鼠下丘腦室旁核內(nèi)c-fos與CRHmRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,提示c-fos可能參與調(diào)節(jié)了CRHmRNA的表達(dá),其機制與HPA軸活性有關(guān)。3.2不同給藥劑量對東南角緣菌群的影響應(yīng)激反應(yīng)的主要特征是以HPA激活為核心的生理反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SU模型組大鼠下丘腦室旁核內(nèi)CRHmRNA陽性細(xì)胞數(shù)以及血漿ACTH和CORT均明顯高于正常組,表明SU發(fā)病過程中HPA軸被激活,發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者認(rèn)為,當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)時分泌大量的ACTH,使胃液分泌增加,造成黏膜糜爛;類固醇激素分泌增多可抑制表面細(xì)胞的更新,對胃黏膜起破壞作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ACTH和CORT升高與胃液pH值均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,支持應(yīng)激狀態(tài)下ACTH升高導(dǎo)致胃酸分泌增多、胃液酸度增加、損傷胃黏膜的觀點,同時也支持CORT升高破壞胃黏膜屏障的觀點。3.3應(yīng)激對酸鈉為等的增加中k目前認(rèn)為SU的發(fā)生涉及胃黏膜保護(hù)機制削弱、損傷因素作用相對增強及機體的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)等多方面因素。胃酸是最常見的內(nèi)源性損傷因子,在SU形成過程中起著重要作用。盡管不同應(yīng)激條件下胃酸分泌量可以增強或減弱,但因胃黏膜屏障功能減弱而導(dǎo)致實際H+逆向彌散的總量增加,參與了潰瘍的發(fā)生。本實驗中模型組胃液pH值明顯低于正常組、IU明顯高于正常組,且二者呈明顯負(fù)相關(guān)。因此,胃酸在SU發(fā)生中的作用不容忽視,這可被各種制酸劑預(yù)防和治療SU的確切療效所證實。本實驗中采用H2受體阻滯劑雷尼替丁防治SU,取得良好效果,與模型組比較有顯著性差異,也充分說明通過抑制基礎(chǔ)胃酸分泌能夠保護(hù)胃黏膜。3.4對血清c-fos、crhmna、acth和cort的影響中醫(yī)傳統(tǒng)名方“左金丸由黃連六兩(姜汁炒)和吳茱萸一兩(鹽水泡)組成”。臨床及實驗研究表明,左金丸對SU有明顯的防治作用,能明顯對抗各種刺激因素引起的急性胃黏膜損傷,抑制胃黏膜的泌酸功能,抑制內(nèi)、外源性胃泌素誘導(dǎo)的泌酸、抗幽門螺桿菌感染及抑制小鼠胃排空等。本研究結(jié)果顯示,左金丸各劑量組均可明顯升高胃液pH值,減少潰瘍發(fā)生率;其中高劑量組可減少下丘腦室旁核內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá),高、中劑量組可減少下丘腦室旁核CRHmRNA的表達(dá);可降低ACTH水平;高、中、低各劑量組可降低CORT水平,其中高劑量組的療效為佳,接近正常組水平。說明左金丸不僅能夠抑制胃酸分泌、升高胃液pH值、保護(hù)胃黏膜,還通過減少下丘腦室旁核內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá),抑制HPA軸的激活和活性,下調(diào)應(yīng)激反應(yīng)強度,從而發(fā)揮中樞應(yīng)激調(diào)節(jié)作用。雷尼替丁通過競爭性與壁細(xì)胞上的H2受體結(jié)合