秋水仙素誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮多倍體的研究

秋水仙素誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮多倍體的研究

彩色馬蹄蓮是黃色馬蹄蓮和紅色馬蹄蓮的總稱。屬于天南星科araceama蹄蓮科zanddistia球根花，色澤鮮艷，形狀優(yōu)雅。它不僅是花的最佳種類，也是盆栽花卉的優(yōu)良栽培。它被公認(rèn)為21世紀(jì)的“花星”。彩色馬蹄蓮在中國還屬新興的貴族花卉,有很大的開發(fā)價(jià)值和市場發(fā)展?jié)摿?。彩色馬蹄蓮絕大多數(shù)為二倍體(2n=2x=32),存在花朵小,不耐高溫,易感軟腐病的問題。本研究旨在采用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合秋水仙素化學(xué)誘導(dǎo),獲得黃色馬蹄蓮四倍體新種質(zhì),加快彩色馬蹄蓮新品種的選育進(jìn)程。1材料和方法1.1材料表面1.1.1測試材料1.1.2試劑1.1.3培養(yǎng)基1.2測試方法1.2.1馬蹄蓮球莖的制備種球先用100mg·L-1的赤霉素(GA3)浸泡處理3h,促進(jìn)芽眼的萌發(fā)。20d左右芽眼萌動(dòng)后,采用質(zhì)量濃度3mg·L-1的多菌靈處理已萌動(dòng)的黃色馬蹄蓮球莖,在搖床上振蕩處理24h后取出,用軟毛刷刷洗,并用刀片刮去表面褐色皮層,自然水下沖洗。挖取0.5cm2的芽眼,在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇漂洗10s,再用1.0g·L-1升汞滅菌20min,無菌水清洗5次,接種于MS培養(yǎng)基上。經(jīng)初代培養(yǎng),芽長高至2cm時(shí),將芽對(duì)半切開,轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基+2.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA誘導(dǎo)獲得愈合組織。愈合組織繼代培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA。1.2.2浸泡時(shí)間及秋水仙素處理采用離體浸泡法結(jié)合組織培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體,在25~30℃的溫度條件下進(jìn)行處理。處理分2步進(jìn)行:(1)選用愈合組織繼代后產(chǎn)生的芽點(diǎn),放入0.2,0.5,1.0g·L-1的秋水仙素溶液中分別浸泡處理24,48,72h,80r·min-1振蕩處理,以無菌水浸泡處理同樣時(shí)間為對(duì)照;(2)處理結(jié)束后,用無菌水清洗3~5次,轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)成苗,并誘導(dǎo)生根。每個(gè)組合處理芽點(diǎn)30個(gè)(表1)。1.2.3-羥基喹啉采用直接觀察染色體數(shù)目的方法,參照李懋學(xué)的去壁低滲火焰干燥法。切取組培苗根尖→預(yù)處理3h(0.002mol·L-1的8-羥基喹啉)→固定2h(固定液)→前低滲(去離子水浸泡至無味)→酶解(30g·L-1的混合酶液)→后低滲(去離子水浸泡10min)→再固定→涂片→Giemsa染色→鏡檢。染色體數(shù)目檢測重復(fù)5次以上,檢測的分裂細(xì)胞中85%以上為四倍體細(xì)胞,確定為四倍體植株。1.2.4體組培苗葉片厚度測定隨機(jī)選取培養(yǎng)條件一致、生長良好的四倍體和二倍體組培苗葉片10張,用直尺測量株高、葉片的長和寬;游標(biāo)卡尺測出葉片的厚度。求出平均值作為不同倍性的株高、葉長、葉寬和葉厚。重復(fù)3次。1.2.5氣孔及葉綠體數(shù)目分別隨機(jī)選取有代表性的葉片3張,用尖鑷子撕取下表皮,置于載玻片上,用碘-碘化鉀溶液染色,加蓋玻片。在普通顯微鏡10×20倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下的氣孔數(shù)目,表示氣孔密度(個(gè)·視野-1);并在10×100倍鏡下統(tǒng)計(jì)30個(gè)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目。在Olympus顯微鏡(目鏡帶測微尺)10×40倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,測量10個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的長度和寬度。每個(gè)樣品每葉重復(fù)觀測3次,計(jì)算平均值求出不同倍性的氣孔密度、葉綠體數(shù)目和保衛(wèi)細(xì)胞大小。1.3處理數(shù)據(jù)運(yùn)用對(duì)比試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù),差異顯著性分析采用Duncan的新復(fù)極差法(SSR)。2結(jié)果與分析2.1倍體誘導(dǎo)的復(fù)育用素質(zhì)量濃度對(duì)植物的傷害程度秋水仙素對(duì)植物有一定的毒害作用,合適的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對(duì)植物誘導(dǎo)染色體加倍至關(guān)重要。研究表明,秋水仙素對(duì)黃色馬蹄蓮球莖芽點(diǎn)的生長影響較大,經(jīng)秋水仙素浸泡處理后,有的芽點(diǎn)直接死亡,有的芽點(diǎn)在培養(yǎng)過程中慢慢褐化失去生活力,有的雖然沒有褐化死亡,但無法繼續(xù)分化成苗,有的即便能夠分化成苗,但生長出現(xiàn)畸形。從表1統(tǒng)計(jì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出:隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的加大,對(duì)植物材料的傷害也隨之加大,芽點(diǎn)的死亡數(shù)增多;用秋水仙素浸泡的時(shí)間越長,對(duì)材料的傷害也越大。四倍體的誘導(dǎo)率并沒有和使用秋水仙素的質(zhì)量濃度及處理時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。不同質(zhì)量濃度的秋水仙素的不同處理時(shí)間效果比較表明:0.5g·L-1秋水仙素處理24,48和72h均有較高的四倍體誘導(dǎo)率,但以采用0.5g·L-1的秋水仙素處理48h的組合較好,有63.33%的成活率和13.3%的四倍體誘導(dǎo)率(圖1)。2.2倍體植株的形態(tài)特征與二倍體植株相比,四倍體黃色馬蹄蓮在培養(yǎng)基中具有以下特征:生長旺盛,株型高大,葉柄粗長,葉色濃綠,葉片變長變寬,葉面積變大,葉尖變尖且反卷,葉脈粗等(圖2)。從表2可以看出,在株高和葉片形態(tài)上,四倍體植株體現(xiàn)了器官的巨大性:株高為二倍體的134.3%,差異極顯著;葉片的長度和寬度均大于二倍體,長度為二倍體的126.6%,寬度為二倍體的151.7%;葉片明顯增厚,為二倍體的159.2%,達(dá)顯著性差異;葉形指數(shù)變小,為二倍體的83.1%。程金水認(rèn)為,多倍體器官的巨大性是隨著染色體的加倍,細(xì)胞核和細(xì)胞變大,因而組織器官也多變大。2.3氣孔密度和葉綠體數(shù)目氣孔是植物葉片與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道,氣孔特征與植物的光合作用性能密切相關(guān)。觀察發(fā)現(xiàn),與二倍體植株比較,四倍體植株葉片氣孔相關(guān)特征有差異(圖3):四倍體的氣孔密度變小,為二倍體的59.7%;保衛(wèi)細(xì)胞變大,縱徑為二倍體的156.1%,橫徑為二倍體的143.2%;葉綠體數(shù)目增加,為二倍體的213.7%。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示各項(xiàng)特征差異極顯著(表3)。這表明黃色馬蹄蓮的倍性與氣孔密度存在著負(fù)相關(guān)的關(guān)系,與保衛(wèi)細(xì)胞的大小、葉綠體的數(shù)目呈正相關(guān)的關(guān)系。這與有關(guān)報(bào)道相一致。本試驗(yàn)中,植物葉片的氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞的大小、葉綠體數(shù)目等特征可以作為判斷黃色馬蹄蓮倍性的輔助方法之一。3討論3.1秋水仙素處理的作用機(jī)制秋水仙素是目前人工誘導(dǎo)染色體加倍應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)試劑,其毒性極強(qiáng),如果處理時(shí)所用的質(zhì)量濃度太大,會(huì)影響植物材料的正常生長,甚至死亡;但處理質(zhì)量濃度太小,又往往起不到作用。處理的適宜時(shí)間以處理材料完全被浸透,并有足夠的藥量進(jìn)入生長點(diǎn)細(xì)胞為準(zhǔn),而且處理所持續(xù)的時(shí)間還受到誘變劑的水解半衰期影響。一般情況下,使用較高質(zhì)量濃度的秋水仙素時(shí)處理時(shí)間縮短,反之則延長處理時(shí)間,但具體因植物材料的種類而異。秋水仙素常用的有效質(zhì)量濃度范圍是0.1~10.0g·L-1,一般以2.0~5.0g·L-1較好。在本研究中,秋水仙素的有效質(zhì)量濃度為0.2~1.0g·L-1,處理時(shí)間和質(zhì)量濃度的大小相關(guān),結(jié)果顯示以0.5g·L-1處理48h為最佳組合。3.2形態(tài)觀察和多倍體染色體計(jì)數(shù)法是鑒定倍性最直接,也是最準(zhǔn)確的方法。由于黃色馬蹄蓮組培苗的莖尖極短,且包裹于葉片內(nèi),切取莖尖進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)極容易完全破壞植株,故只能等植株生根,然后利用根尖進(jìn)行檢測。利用根尖染色體進(jìn)行鑒定會(huì)出現(xiàn)染色體缺失或增多等現(xiàn)象,需要經(jīng)過多次反復(fù)的檢測,操作過程繁瑣,工作量大,難以早期分離多倍體。形態(tài)觀察是鑒定多倍體最簡單最快捷的方法。本研究獲得的四倍體組培苗與二倍體相比,表現(xiàn)出葉片加厚,葉色較深,葉片變長、變寬、葉形指數(shù)變小等特點(diǎn),可作為對(duì)變異植株的初步篩選,能大大減少工作量。但該法過于粗糙,且組培苗移栽于大田管理過程中會(huì)出現(xiàn)性狀差異,故該法需與其他方法結(jié)合進(jìn)一步鑒定。許多研究證明,氣孔大小和密度與染色體倍性存在明顯的相關(guān)性,葉綠體數(shù)目能大致反應(yīng)植物的倍性,這在許多果樹及農(nóng)作物等植物的多倍體研究中也得到證實(shí)。本研究中四倍體植株和二倍體的氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞長度、寬度和葉綠體數(shù)目存在極顯著差異,可作為鑒別黃色馬蹄蓮倍性的重要參數(shù)。3.3馬蹄蓮的選育植物多倍體一般比二倍體具有開花多,莖干粗壯,葉片肥厚,花朵大而艷麗,花瓣厚實(shí)、耐儲(chǔ)運(yùn),抗逆性增強(qiáng)等的特點(diǎn),這在百合Liliumspp.,非洲菊Gerberajamesonii,香石竹Dianthuscaryophyllus等花卉植物中已有較多的報(bào)道。本試驗(yàn)研究獲得的黃色馬蹄蓮四倍體表現(xiàn)了器官的巨大性:株型高大,葉柄粗長,葉色濃綠,葉面積變大,葉脈粗等,并表現(xiàn)為生長旺盛。但黃色馬蹄蓮從瓶苗到開花需要2~3a。本研究誘導(dǎo)獲得的黃色馬蹄蓮多倍體植株尚未能成花,這將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步開展。黃色馬蹄蓮四倍體植株可用于馬蹄蓮的進(jìn)一步育種,如四倍體與二倍體雜交產(chǎn)生三倍體,四倍體加倍獲得八倍體,再雜交獲得六倍體等等,為進(jìn)一步培