失眠動物模型的制作及評價

失眠動物模型的制作及評價

失眠是臨床上最常見的睡眠障礙類型，通常指患者對睡眠時間和（或）質(zhì)量缺乏，并影響日常社會功能的主觀體驗(yàn)。失眠表現(xiàn)為入睡困難(入睡時間超過30min)、睡眠維持障礙(整夜覺醒次數(shù)≥2次)、早醒、睡眠質(zhì)量下降和總睡眠時間減少(通常少于6h),同時伴有日間功能障礙。中國睡眠研究會公布的調(diào)查結(jié)果顯示,中國成年人失眠發(fā)生率為38.2%,高于發(fā)達(dá)國家。長期失眠對于正常生活和工作會產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響,甚至?xí)?dǎo)致惡性意外事故的發(fā)生?？梢娛卟粌H是醫(yī)學(xué)問題還是社會問題,失眠癥的研究與防治工作已經(jīng)迫在眉睫。在生物醫(yī)學(xué)研究中,適合的動物模型常用以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及臨床假說,進(jìn)而有效地認(rèn)識疾病的預(yù)防及發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,失眠的防治及機(jī)理研究也不例外,需要有合適的失眠動物模型作為研究載體。本文從造模的中醫(yī)、西醫(yī)指導(dǎo)理論出發(fā),對目前一些常用動物失眠模型的制作及評價進(jìn)行系統(tǒng)的回顧并展望日后可能發(fā)展的方向,以期為失眠癥及催眠藥物研究提供更多幫助。1臨床睡眠模型在失眠的研究過程中,研究者們已選用過大鼠、小鼠、貓、猴等動物構(gòu)建動物模型。生物的睡眠結(jié)構(gòu)存在差異,有研究表明大腦體積與睡眠周期中各階段的長度呈正相關(guān)。低等哺乳動物如嚙齒類動物易繁殖、易飼養(yǎng),麻醉及手術(shù)操作簡單,維護(hù)費(fèi)用較低,雖其睡眠時相及睡眠周期均與人類有差異,不能完全模擬臨床失眠癥狀,但嚙齒類和人類存在相似的睡眠穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)生化調(diào)節(jié)機(jī)制,因此較適合用于失眠模型的制作。此外,就最常用于造模的大鼠而言,Sprague-Dawley和Wistar是兩種常用于各種生理調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)的雜交鼠,這兩種大鼠間Wistar較Sprague-Dawley有顯著較大的睡眠總量比值L/D,所以對光照期的睡眠剝奪或睡眠干擾Wistar有可能表現(xiàn)出更多的在黑暗期睡眠總量的增加,此特點(diǎn)可作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計選擇失眠模型動物的參考。2失眠動物模型的構(gòu)建2.1基于中醫(yī)理論的失眠模型多年來經(jīng)過學(xué)者們的積極探索,現(xiàn)已通過單因素造模法和多因素造模法制作了多類中醫(yī)證候動物模型。2.1.1中醫(yī)證候?qū)傩源笫筮B續(xù)3周灌服甲狀腺素片混懸液820.5mg·(kg·d)-1,模型組大鼠表現(xiàn)出自發(fā)活動、飲水量、進(jìn)食量顯著增加,體質(zhì)量顯著降低,其整體癥狀與中醫(yī)心陰虛證中心悸、怔忡、失寐等癥相似。此外,有研究對目前公認(rèn)的失眠模型的中醫(yī)證候?qū)傩赃M(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)對氯苯丙胺酸(PCPA)失眠模型與中醫(yī)心腎不交型失眠病證相似。此類造模方法相對簡單,但是中醫(yī)病癥并非單一因素所致,因此,不能較好地模擬中醫(yī)四診所表達(dá)的證候特征,有待進(jìn)一步改進(jìn)。2.1.2補(bǔ)充肝郁睡眠大鼠模型單因素造模不能很好地模擬中醫(yī)研究中所需的證候,隨著中醫(yī)藥失眠研究的深入,多因素復(fù)合模型應(yīng)運(yùn)而生。此類模型多采用已存在的公認(rèn)失眠模型或造模方法與其他藥物或刺激相結(jié)合的方式,已達(dá)到有效模擬病癥結(jié)合。有研究采用慢性夾尾刺激和腹腔注射PCPA復(fù)合因子造模法建立肝郁失眠大鼠模型,模型鼠表現(xiàn)出與肝郁失眠證相似的宏觀體征。黃攀攀等在D-半乳糖制作亞急性衰老模型基礎(chǔ)上,采用咖啡因腹腔注疊加多平臺水環(huán)境持續(xù)睡眠剝奪法制作老年陰虛失眠大鼠模型,證候方面表現(xiàn)與陰虛證候有很強(qiáng)的相關(guān)性。多因素復(fù)合造模能較好的模擬中醫(yī)證候特點(diǎn),做到病證結(jié)合,但模型在模擬主證的同時也往往會出現(xiàn)多種證候并存的情況,如陰虛模型,同時兼有氣虛和血虛的體征,因此,模型對應(yīng)證候的準(zhǔn)確性和一致性有待進(jìn)一步改進(jìn)。2.2基于西醫(yī)的理論指導(dǎo)和失眠模型2.2.1物理方法的建模2.2.1.tsd或選擇性睡眠剝奪此類方法在腦電監(jiān)控下可用于全部睡眠剝奪(totalsleepdeprivation,TSD)或選擇性睡眠剝奪(selectivesleepdeprivation,SSD),共同特點(diǎn)是通過動力裝置迫使大鼠不停地運(yùn)動,從而達(dá)到睡眠剝奪的目的。較有代表意義的是旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪法與水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法。2.2.1.大鼠平臺及改良多平臺的發(fā)展階段主要利用嚙齒鼠畏水的生活習(xí)性,裝置由水槽及高于水平面1cm的平臺組成,嚙齒鼠可在平臺上站立或進(jìn)入非快速動眠睡眠(NREM),但當(dāng)其進(jìn)入快速動眼睡眠(REM)時,全身肌張力降低引起節(jié)律性低頭、觸水,從而無法進(jìn)入REM。其發(fā)展歷經(jīng)了單平臺、多平臺及改良多平臺三個階段。關(guān)于小平臺的面積多有不同報道,據(jù)Mendelson等的工作,大鼠體質(zhì)量(W)與站臺面積(A)的比值W/A需≥6.4時,才能得到滿意的REM睡眠剝奪,而對照組W/A≤1.73時可允許自由睡眠。目前,實(shí)驗(yàn)研究中大鼠平臺直徑多選用6.5cm,小鼠多選用2.4cm,且直徑10cm的平臺可用于大鼠REM的不完全剝奪,直徑6~7cm的可用于最大REM剝奪。此類方法簡單易行,對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高,在不同條件實(shí)驗(yàn)條件均能應(yīng)用,因此廣泛應(yīng)用于REM睡眠剝奪,其中,改良多平臺水環(huán)境睡眠剝奪法(modifiedmultipleplatformmethod,MMPM)是較為理想的REM剝奪方法。2.2.1.旋轉(zhuǎn)滌綸裝置及系統(tǒng)的改良裝置是由1個柱形圓筒和小型慢速馬達(dá)構(gòu)成,通過圓筒的轉(zhuǎn)動帶動大鼠不停運(yùn)動而達(dá)到睡眠剝奪的目的。此方法可在旋轉(zhuǎn)速度和幅度上進(jìn)行不同調(diào)整。Leenaars等對旋轉(zhuǎn)圓筒裝置及系統(tǒng)進(jìn)行改良,在12h睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)中,裝置根據(jù)程序設(shè)定轉(zhuǎn)動速度和方向隨時間推移遞增,該改良方法有效的增加了大鼠自主活動,減小了老鼠實(shí)驗(yàn)過程的離群感,并使應(yīng)激反應(yīng)最小化,使皮質(zhì)酮濃度保持在生理范圍。此類方法睡眠剝奪效果顯著,睡眠剝奪可重復(fù)性好,且睡眠剝奪長度及強(qiáng)度易于掌控,但長時間受迫運(yùn)動所引起的應(yīng)激反應(yīng),可能影響睡眠剝奪的效果,其中改良旋轉(zhuǎn)圓筒法可以有效降低應(yīng)激反應(yīng),為較理想的強(qiáng)迫運(yùn)動法。2.2.1.tsd和ss實(shí)驗(yàn)又稱disk-over-water-method,由Rechtschaffen在1983最早使用該方法,可進(jìn)行TSD和SSD實(shí)驗(yàn)。該法的優(yōu)點(diǎn)為可同時對兩只大鼠進(jìn)行REM睡眠剝奪,且可減少因?qū)嶒?yàn)條件不同所致的應(yīng)激反應(yīng)。2.2.1.sd模型的建立此法共同點(diǎn)為觀察到大鼠即將進(jìn)入睡眠狀態(tài)時,通過物理刺激使其保持清醒,以建立慢性SSD模型。該法優(yōu)點(diǎn)為刺激強(qiáng)度相對其他方法較小,且操作簡便易行,缺點(diǎn)在于個體對物理刺激感應(yīng)程度存在差異,且在無腦電圖監(jiān)測條件下,實(shí)驗(yàn)過程需實(shí)驗(yàn)人員始終觀察大鼠行為,易對實(shí)驗(yàn)人員產(chǎn)生睡眠剝奪效應(yīng),進(jìn)而引起誤差,因而適用于短時間睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)。2.2.2pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcp/基于實(shí)驗(yàn)動物的睡眠剝奪根據(jù)西醫(yī)理論使用化學(xué)制劑制作的睡眠剝奪動物模型,一種為腹腔或皮下注射藥物(多為一些中樞興奮藥)進(jìn)行部分或全部睡眠剝奪,如腹腔注射PCPA對嚙齒鼠進(jìn)行睡眠剝奪,多用在研究某些催眠藥物藥理作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究中。此類方法操作簡便易行,不需特殊儀器,但鑒于實(shí)驗(yàn)動物的個體差異,睡眠剝奪的效果不易掌控;另外一種為直接進(jìn)行中樞微量給藥,有助于催眠藥物作用機(jī)制的深入研究,此類方法,造模原因確定,但對給藥部位及劑量均有較高要求,不易掌握。3模型動物的診斷標(biāo)準(zhǔn)人類疾病的動物模型必須具有人類疾病模擬性表現(xiàn),但目前沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)判斷以上模型動物是否已經(jīng)達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。從文獻(xiàn)結(jié)果分析,失眠動物模型制作后是否符合人類疾病模擬性表現(xiàn),主要有以下檢驗(yàn)途徑。3.1睡眠情況的描述分析目前,在實(shí)驗(yàn)過程中主要利用腦電圖(EEG)以及肌電圖(EMG)、眼點(diǎn)圖(EOG)對睡眠情況進(jìn)行描述分析。腦電所示相應(yīng)睡眠時間或者睡眠質(zhì)量的變化更是檢測模型是否制作成功的金指標(biāo)。3.2確定戊巴比妥鈉的閾值此法以睡眠潛伏時間、睡眠時間以及睡眠率等參數(shù)來判斷模型動物是否失眠,為經(jīng)典的的失眠模型評價指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)前宜進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定戊巴比妥鈉的閾上劑量及閾下劑量,通常閾上劑量為30~45mg·kg-1,閾下劑量常選用28mg·kg-1。實(shí)驗(yàn)中以動物翻正反射消失達(dá)1min為入睡指標(biāo),以30s內(nèi)翻轉(zhuǎn)達(dá)3次為睡眠結(jié)束指標(biāo)。3.3確定睡眠動物模型的方法中醫(yī)疾病證型的判定有兩種方法,即正證與反證:正證即辨證求因,反證即以方測證。從病證判定思想的指導(dǎo)出發(fā),評價具備中醫(yī)證候的失眠動物模型可以通過以下2種方法:①結(jié)合不同證形的體征特點(diǎn),觀察動物體征(如活動、飲食、體質(zhì)量、毛色等)是否符合,以判定造模是否成功;②通過觀察不同方劑對該證候模型動物所起的作用或觀察相應(yīng)證型的經(jīng)典方藥對該模型的作用以確定該失眠動物模型的證型歸屬。中醫(yī)研究具備病-證-法-方一一對應(yīng)的特點(diǎn),結(jié)合這一特點(diǎn),在現(xiàn)代中醫(yī)證候模型研制工作中,藥物反證已經(jīng)成為衡量模型成功與否的普遍標(biāo)準(zhǔn)。4對臨床造成的影響從用于模型制作的動物選擇上來說,多數(shù)睡眠研究采用正常動物,失眠模型主要為整體施加生理性造模因素所致,存在可逆性,故尚難準(zhǔn)確評價藥物的睡眠誘導(dǎo)作用及其機(jī)理。就模型檢測而言,目前,一直將腦電所示相應(yīng)睡眠時間或者睡眠質(zhì)量的變化作為檢測模型是否制作成功的金指標(biāo)。但有研究表明,傳統(tǒng)的小鼠抓捕方式會造成小鼠焦慮。小鼠麻醉后植入電極,其本身就可能造成小鼠焦慮進(jìn)而對其睡眠產(chǎn)生影響,電極植入后獨(dú)立測定腦電,改變了小鼠原來的群居生活環(huán)境,也可影響睡眠。因此,無創(chuàng)傷非侵入性EEG與EMG監(jiān)測等儀器亟待開發(fā)。從造模方法而言,單純的睡眠剝奪模型并未能真正模擬臨床中失眠患者不易入睡、醒后不易再入睡的狀態(tài),即不能完全反應(yīng)臨床失眠變化的病理過程;各種方法對睡眠的影響與刺激的頻率、強(qiáng)度、時間、持續(xù)時間及動物個體對于刺激的易感性等多方面因素有關(guān),總體來說,輕度和短期的刺激易導(dǎo)致REM睡眠增加,而長期和大力度的刺激則傾向于擾亂睡眠可以更好的模擬患者的病理狀態(tài)。因此,在減小模型應(yīng)激反應(yīng)的基礎(chǔ)上更好的反應(yīng)臨床失眠變化病理過程是未來造模方法發(fā)展的一個出發(fā)點(diǎn),此外,還應(yīng)根據(jù)引起睡眠問題的病因建立相應(yīng)的動物模型。動物模型規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化是保證中醫(yī)藥現(xiàn)代化研