電和化學刺激下丘腦室旁核對大鼠胃缺血再灌注損傷的影響

電和化學刺激下丘腦室旁核對大鼠胃缺血再灌注損傷的影響

近年來，通過這項研究，我們注意到了有關大腦室旁核（pvn）及其相關核團（藍色斑點和中縫背核）對磺酰胺鈉中毒大鼠胃粘膜損傷的調(diào)節(jié)作用。孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)是腦干內(nèi)接受內(nèi)臟初級感覺傳入信息的重要核團,與PVN有密切的結構和機能聯(lián)系。在各種應激(如水浸束縛的復合應激、電擊足底的單一應激)情況下,腦內(nèi)PVN及NTS均有大量的c-fos表達,董元祥等報道胃傷害性刺激(胃內(nèi)導入甲醛)后PVN、NTS內(nèi)亦有大量的c-fos表達。臨床上各種原因(諸如出血性休克、消化道潰瘍及血管病變出血等)導致的胃缺血/再灌注損傷(gastricischemia/reperfusioninjury,GI/RI),對機體均可造成應激性影響,但PVN、NTS是否參與對大鼠GI-RI的調(diào)控作用尚無報道。為此,我們采用電和化學刺激、電損毀手段觀察PVN、NTS與GI/RI之間的關系,并采用c-fos誘導和顯示技術,觀察GI/RI后PVN、NTS內(nèi)Fos蛋白的表達情況,從而進一步揭示PVN、NTS對GI-RI的調(diào)控作用。1材料和方法1.1pvn的制備選用成年健康的SD雄性大鼠80只,體重180～220g,分為正常對照組、假電刺激PVN組、電刺激PVN組;PVN內(nèi)微量注射配藥液組、微量注射L-谷氨酸(L-Glu)組;雙側假損毀NTS+假電刺激PVN+GI/RI組、假損毀NTS+電刺激PVN+GI/RI組、損毀雙側NTS+電刺激PVN+GI/RI組;免疫組化設正常對照組、麻醉對照組、手術對照組、實驗組。SD大鼠由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。1.2治療制備pvn的方法將動物頭部固定于腦立體定位儀上,按照Paxinos和Watson腦圖譜及我們以前的方法將外徑0.4mm、內(nèi)芯尖端裸露0.5mm的同心圓刺激電極插入右側PVN(坐標:AP1.5mm,R0.4mm,H7.7～7.8mm,門齒瓣低于耳間線3.3mm),用502膠及自凝牙托粉固定。手術結束后即行電刺激,電刺激PVN的參數(shù)為單相方波,波寬0.2ms,強度為0.4mA,頻率50Hz,持續(xù)1min,刺激脈沖通過隔離器恒流輸出,每間隔10min刺激一次,共5次。刺激完畢立即進行胃缺血/再灌注,假電刺激組只埋藏電極,不予刺激。電損毀NTS大鼠以戊巴比妥鈉(30mg/kgip)麻醉后,用直徑0.3mm、尖端裸露0.3mm的絕緣不銹鋼針插入兩側NTS(坐標:AP13mm,R0.6-0.8mm,H7.7-7.8mm),通以陽極直流電(1mA、10s)進行電解損毀。3d后實驗。假損毀組只插針不通電。PVN內(nèi)微量注射仍按上述坐標定位,用微量注射器在2min內(nèi)將3%L-谷氨酸0.5μl緩慢注入,留針3min;對照組以同樣方法等量注入溶劑。1.3胃損傷的測定按Wada等方法進行。將大鼠剖腹,仔細分離腹腔動脈與周圍組織后,用動脈夾夾閉腹腔動脈30min后去除,恢復血流再灌注60min。實驗結束后,取胃于10%的福爾馬林溶液中固定,測量胃損傷情況。即將已固定的胃沿大彎側剪開,沖洗,展平,采用Guth等方法測量計算損傷指數(shù)(damageindex)作為胃缺血/再灌注損傷的指標:以局限于胃粘膜上皮的點狀糜爛、潰瘍、出血灶的長度累積計分:0分為正常,1分≤1mm,2分≤2mm,3分≤3mm,余類推;損傷寬度超過1mm時加倍記分。每組大鼠損傷分數(shù)的平均值即為損傷指數(shù),由不參與本實驗的人員計數(shù)。1.4免疫組織化學abc法大鼠術前于安靜、溫暖(15～18℃)、避強光的環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)24～48h,在烏拉坦麻醉下,經(jīng)升主動脈用生理鹽水約100ml沖去血液;繼之灌注冷的4%多聚甲醛(0.01mol/LPBSpH7.4配制)約500ml;注畢立即取腦,置于相同固定液內(nèi)浸泡2h,然后移入30%蔗糖溶液內(nèi)直至腦塊沉底。冰凍連續(xù)冠狀切片,片厚40μm,用于Fos免疫組織化學染色。免疫組織化學反應(ABC)法切片首先用0.01mol/LPBS充分洗滌,將切片入0.3%TritonX-100,室溫30min,洗滌后入10%的羊血清室溫30min,以后切片依次入:(1)兔抗Fos抗血清(1∶2000)37℃4h,室溫18h。(2)結合生物素的羊抗兔IgG(Vector,1∶300),室溫12h。(3)ABC復合物(Vector,1:300)37℃4h。每級抗體孵育之后均用0.01mol/LPBS洗滌切片,5×10min。最后用葡萄糖氧化酶二氨基聯(lián)苯胺(DAB)呈色,室溫下反應10～15min。用水洗滌后,裱片、晾干、脫水、透明、中性樹膠封片。Olympus顯微鏡觀察并照相。1.4.1不同因素對c-fos表達的影響正常對照組(n=2):將在術前環(huán)境喂養(yǎng)24～48h的大鼠,以烏拉坦麻醉后立即經(jīng)升主動脈灌注并作Fos免疫組織化學反應,以觀察動物在基礎狀態(tài)下c-fos表達的狀態(tài)。麻醉對照組(n=2):將置于術前環(huán)境大鼠,禁食過夜后,烏拉坦麻醉,存活2h后灌注以作Fos免疫組織化學反應,以觀察麻醉與禁食兩個因素對c-fos表達的影響。手術對照組(n=2):即假手術組,大鼠禁食后以烏拉坦麻醉,打開腹腔,將胃拉出腹腔后再還納進去,用于觀察手術等因素對c-fos表達的影響。1.4.2試驗組n.6即單純GI/RI組,其具體操作見模型制備。1.5統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,多組間比較采用完全隨機設計方差分析。2電刺激、損壞和注射部位的組織學鑒定根據(jù)Paxinos和Watson腦圖譜,對實驗中所有核團的刺激、損毀和注射部位進行組織學鑒定,其中電刺激PVN及電損毀NTS的組織學圖片見圖1。2.1不同電刺激pvn對di/ri的保護作用以單純GI/RI組作為對照組。0.4mA電刺激PVN后GI-RI明顯減輕,經(jīng)統(tǒng)計學處理,電刺激組與對照組、假電刺激組相比有顯著性差異(P<0.01)。表明電刺激PVN對GI/RI具有保護作用。將興奮性氨基酸L-谷氨酸(L-Glu)注入動物一側PVN后,其GI/RI程度較注入配藥液組明顯減輕(P<0.05),與電刺激PVN組的效應相似。表明電刺激PVN減輕大鼠GI/RI系因該核團神經(jīng)元受刺激而興奮所致(圖2)。2.2兩組的胃粘膜損傷比較雙側假損毀NTS+假電刺激PVN+GI/RI組作為對照組(n=8),假損毀NTS+0.4mA電刺激PVN+GI/RI組(n=6)的胃粘膜損傷與對照組相比明顯減輕(P<0.05);損毀雙側NTS+0.4mA強度刺激PVN+GI/RI組(n=6)的胃粘膜損傷與對照組相似,與假損毀NTS+電刺激PVN+GI/RI組相比,胃粘膜損傷顯著加重(P<0.05)。表明損毀NTS能消除PVN對GI/RI的保護效應,提示NTS可能參與PVN引起的保護作用(圖3)。2.3pvn、nts內(nèi)fos免疫陽性神經(jīng)元的表達Fos免疫陽性神經(jīng)元細胞核呈黑色,著色有深、中等和淺三個層次,胞漿不著色。正常對照組的大鼠,PVN、NTS內(nèi)偶見Fos免疫陽性神經(jīng)元,麻醉對照組及假手術組PVN、NTS內(nèi)見少量Fos免疫陽性神經(jīng)元,但其表達強度明顯弱于實驗組。實驗組PVN、NTS內(nèi)有大量Fos免疫陽性神經(jīng)元,比對照組顯著增多,均為雙側性分布,無明顯側別差異。在NTS內(nèi),Fos陽性神經(jīng)元主要密集分布與中尾段的內(nèi)側亞核和聯(lián)合亞核,而在腹外側亞核、背側亞核、及吻側NTS內(nèi)僅有少量散在分布的Fos陽性神經(jīng)元?？梢?GI/RI性刺激可誘導PVN、NTS內(nèi)c-fos的廣泛表達,進一步從形態(tài)學上驗證了PVN、NTS對GI/RI具有調(diào)控作用(圖4見彩圖頁Ⅰ)。3nts參與了pvn對di/ri的調(diào)控下丘腦室旁核是結構和功能均非常復雜的神經(jīng)核團,主要由大細胞神經(jīng)元和小細胞神經(jīng)元共同組成,具有廣泛的投射,包含有多種神經(jīng)遞質(zhì)(其中包括神經(jīng)肽)。它對生理及應激狀態(tài)下的胃酸分泌、胃運動、胃電活動均具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。近年來的研究表明,PVN對胃傷害性刺激亦有重要調(diào)節(jié)作用,且與應激反應有密切關系。為此,我們研究了電刺激PVN對大鼠GI/RI的影響。本工作觀察到,夾閉大鼠腹腔動脈30min再灌注1h可造成胃粘膜片狀、條索狀、點狀的出血性損傷,電和化學刺激PVN后GI/RI明顯減輕,說明了下丘腦PVN與GI-RI之間有密切關系,電刺激PVN對GI/RI具有保護作用,它可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)控大鼠GI/RI的特異性部位之一。辣根過氧化物酶跨越神經(jīng)節(jié)追蹤實驗已證明,大鼠胃腸道的初級傳入纖維經(jīng)迷走神經(jīng)主要終止于NTS的內(nèi)側亞核,其次為背側亞核、連合亞核和膠狀質(zhì)亞核。給予胃腸道傷害性刺激后,NTS的內(nèi)側亞核含有大量Fos陽性神經(jīng)元,而在其它亞核內(nèi)數(shù)量較少,說明NTS的各亞核中,內(nèi)側亞核可能與接受和傳遞來自胃腸道傷害性刺激信息的關系更為密切。本研究發(fā)現(xiàn)雙側損毀NTS,能完全取消電刺激PVN對GI/RI的保護作用,提示NTS參與了PVN對GI/RI的調(diào)控。由于c-fos表達法可以檢測外周臟器受到刺激后而被激活的中樞多級神經(jīng)元,并具有敏感性高的優(yōu)點,所以實驗中進一步觀察了GI/RI后PVN、NTS等核團c-fos表達情況。結果發(fā)現(xiàn)正常對照組僅見數(shù)個c-fos陽性神經(jīng)元,表明基礎狀態(tài)是穩(wěn)定的。麻醉對照組及假手術組PVN、NTS內(nèi)出現(xiàn)了