室旁核微量注射催產(chǎn)素對(duì)大鼠胃缺血-再灌注損傷的調(diào)控機(jī)制

室旁核微量注射催產(chǎn)素對(duì)大鼠胃缺血-再灌注損傷的調(diào)控機(jī)制

0p-jsk對(duì)di-r損傷的調(diào)控作用由于氧化反應(yīng)和出汗，氧化反應(yīng)與身體的氧化反應(yīng)密切相關(guān)。在大腦中的vn周細(xì)胞（pvn）表面上有豐富的ot能量來(lái)源于視上核的大細(xì)胞物理學(xué)家，并具有高密度的ot受體。對(duì)于pvn和pvn中的微針ot，可以減少胃腸道的流失并減輕潰瘍。在之前的研究中，電刺激pdn可以減少胃缺氧再感染（gi-r），并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以降低對(duì)pvn內(nèi)顆粒的ot含量。此外，還發(fā)現(xiàn)了對(duì)于不同數(shù)量的ot來(lái)降低mri-r的局部異質(zhì)結(jié)。例如，對(duì)于氨基丙烯酸酯（c-junn-1）和ga-s受體的激活，這是與細(xì)胞生化和死亡密切相關(guān)的主要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶。對(duì)于牛仔布賽-1和c-gan-1）以及生命因素方面的不同表達(dá)。例如，除了出汗、bax、c-junn-1和mc-l-6小時(shí)的中間c-junn-1此外，還包括一個(gè)與細(xì)胞生化和死亡密切相關(guān)的新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)移瘤（c-junn-1）和一個(gè)與基底反應(yīng)元素（c-junn-1）結(jié)合的蛋白（c-junn-1）。這是細(xì)胞內(nèi)最重要的新形式轉(zhuǎn)移瘤（creb）。例如，除了出汗、bax、bcl-2和bcl-1之外，還有激活蛋白1（活動(dòng)武動(dòng)化-1，ap-1）和一個(gè)可執(zhí)行生物反應(yīng)因素（脾臟和大腦啟動(dòng)生命）。例如，除了食欲不振和bax的發(fā)現(xiàn)外，還可能促進(jìn)p-jnk在胃粘膜中的出現(xiàn)。在研究中，我們還表明，一些重要器官（如交感神經(jīng)、腎臟和腦）的缺血性或缺氧可導(dǎo)致p-jnk的激活。根據(jù)我們的研究，一些研究還表明，在30分鐘、1.3和6小時(shí)內(nèi)，p-jnk可以通過(guò)減少食物和粘膜，刺激pd-jnk。然而，一些研究表明，如果jnk是否參與ot對(duì)gi-r的監(jiān)管作用尚不清楚。因此，在建立gi-r模型的基礎(chǔ)上，利用顆粒顆粒中的微針、免疫組織化學(xué)和免疫印刷，研究了巴比妥對(duì)gi-r損傷的控制和機(jī)制。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器成年健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠(220-240g),雌雄不拘,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(使用許可號(hào):SYXK[su]2002-0038)提供.OT購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司;atosiban購(gòu)自深圳翰宇生物工程有限公司.P-JNK小鼠mAb以及Bax、Bcl-2兔多克隆抗體、PowerVisionTM二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、DAB顯色試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖鹽溶液、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG、多聚賴氨酸溶液購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司;堿磷酶底物NBT/BCIP顯色濃縮液購(gòu)自美國(guó)PromegaTechnology.其他試劑均為市售化學(xué)純.1.2方法1.2.1pvn和側(cè)腦室的注射動(dòng)物在麻醉下(10%水合氯醛400mg/kgip)固定于腦立體定位儀上,按照Paxinos和Watson腦圖譜及我們以前的方法定位PVN(坐標(biāo):AP1.5mm,R0.4mm,H7.7-7.8mm,門(mén)齒瓣低于耳間連線3.3mm)和側(cè)腦室(坐標(biāo):AP1.0mm,L1.5mm,H4.5mm.),在2min內(nèi)將OT600ng/0.3μL微量注射到PVN或?qū)tosiban1.2μg/5μL注射到側(cè)腦室.vehicle組注射等體積的生理鹽水.1.2.3胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定按Wadaetal方法進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)大鼠水合氯醛麻醉后,仔細(xì)離腹腔動(dòng)脈與周?chē)M織,用小動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30min后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注60min.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胃計(jì)數(shù)胃黏膜損傷指數(shù),測(cè)量完損傷指數(shù)后將胃組織在10%中性甲醛溶液內(nèi)固定,石蠟包埋切片后用于免疫組織化學(xué)染色.1.2.4半定量和定性方法按照北京中杉生物技術(shù)有限公司提供的PowerVisionTM二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行.DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹(shù)膠封片.光鏡下觀察到胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒者即為陽(yáng)性細(xì)胞.用ImageProPlus圖像析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量析.以高倍視野下累積吸光度(IA)作為析指標(biāo).對(duì)照實(shí)驗(yàn)以PBS緩沖液代替一抗.每例3張間斷切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,取平均值.1.2.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析將已制備的細(xì)胞蛋白提取液測(cè)其蛋白濃度后,經(jīng)100℃水浴變性5min,按每孔30μL蛋白上樣,經(jīng)10%SDS離后,以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上,室溫封閉3h,加入一抗(p-JNK1∶200、Bax1∶800),4℃過(guò)夜,洗膜后加入相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h,洗膜后加入顯色劑(NBT/BCIP顯色試劑盒),反應(yīng)達(dá)到要求后流水洗滌終止反應(yīng).條帶經(jīng)圖像處理儀行激光掃描后測(cè)各條帶吸光度(A),以相應(yīng)區(qū)帶的A值相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)表示.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS9.0forWindows統(tǒng)計(jì)軟件包,數(shù)據(jù)以mean±SD表示,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差析法(One-wayANOVA).P<0.05或P<0.01別表示兩組數(shù)據(jù)間有顯著性差異或有非常顯著性差異.2結(jié)果2.1胃黏黏膜膜中bax表達(dá)變化p-JNK陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在胃黏膜上上層層細(xì)細(xì)胞胞胞胞胞質(zhì)質(zhì)質(zhì)中中中中,,PVN微量注射OOTT((660000ng)可明顯減少GI-R1h(vehicle組)后p-JNK蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),而atosiban可取消OT的這種效應(yīng),與vehicle組無(wú)明顯差異(F=56.33,圖1-2).2.2PVN內(nèi)微量注射OT對(duì)GI-R后胃黏黏膜膜Bax表達(dá)水平的影響B(tài)ax陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在胃黏膜中中下下層層胃胃底底腺腺細(xì)細(xì)胞胞胞胞胞質(zhì)質(zhì)質(zhì)中中中中,,在黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)不明顯.GI-R1h(vehicle組)后胃黏膜Bax蛋白水平較高,PVN微量注射OT(600ng)后,Bax蛋白水平較vehicle組明顯減少(P<0.01),而atosiban可阻斷OT的這種效應(yīng)(F=145.2,P<0.01,圖3-4).2.3胃黏膜中bcl-2/atosiban對(duì)k-ras表達(dá)的影響大鼠胃黏膜Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)黏膜在胃黏膜中下層胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中中下層胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中胞質(zhì)中中,在黏膜上黏膜中下層胃底腺細(xì)胞胞質(zhì)中,皮細(xì)胞中表達(dá)不明顯.GI-R1h后(vehicle組)胃黏膜Bcl-2蛋白水平較低,,PVN微量注射OT(600OT(600ng,OT組)后,Bcl-2蛋白水平較vehicle組明顯升高(P<0.01),而atosiban可阻斷OT的這種效應(yīng)(F=49.32,P<0.01,圖5).5).3pvn提高胃黏膜細(xì)胞p-jken表達(dá)我們最近的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GI-R1h可引起胃黏膜片狀、條索狀、點(diǎn)狀的出血性損傷,單側(cè)微量注射OT到PVN后,能明顯減輕GI-R損傷,并且有劑量依賴性.將OT受體拮抗劑atosiban側(cè)腦室注射后,可阻斷OT對(duì)GI-R損傷的保護(hù)效應(yīng),胃黏膜損傷明顯加重,表明OT對(duì)GI-R損傷的保護(hù)作用,是通過(guò)PVN內(nèi)的OT受體實(shí)現(xiàn)的.但參與這種保護(hù)效應(yīng)的局部因素尚不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)PVN內(nèi)微量注射OT能夠明顯減少p-JNK在胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá),并降低Bax的蛋白水平,增加Bcl-2的蛋白表達(dá).腦室內(nèi)注射OT受體拮抗劑atosiban可取消這些效應(yīng).表明PVN內(nèi)微量注射OT后,在胃黏膜局部通過(guò)抑制黏膜細(xì)胞JNKs信號(hào)通路的激活,從而對(duì)GI-R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用.GI-R導(dǎo)致的胃黏膜細(xì)胞損傷實(shí)際上是一種氧化應(yīng)激反應(yīng),在缺血-缺氧、氧自由基、腫瘤壞死因子-α等胞外刺激信號(hào)的作用下,可激活MAPKs信號(hào)蛋白通路.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)已明確了5條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,別為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/ERK2,也稱為p44/42MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)、p38MAPK(α、β)、ERK5/BMK1和ERK3/4通路.在多種臟器如心、腦、腎等缺血-再灌注后均可激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.Zhouetal發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激引起小腸上皮細(xì)胞凋亡時(shí)JNK1/2表達(dá)迅速增加,抑制JNK信號(hào)通路的激活可減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.Mitsuyamaetal發(fā)現(xiàn)酒精引起胃黏膜損傷形成過(guò)程中,JNK可被快速激活后高水平表達(dá),我們前期的研究也證實(shí)p-JNK的激活參與缺血-再灌注后胃黏膜細(xì)胞的損傷,是重要的致?lián)p傷因素之一.在本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PVN微量注射OT能通過(guò)抑制GI-R胃黏膜細(xì)胞p-JNK的激活,從而減輕GI-R損傷.此外,JNK與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切,他參與了多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.與細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)的基因中,Bcl-2和Bax基因是重要的調(diào)節(jié)因子[22,23,24,25,26,27].現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了一系列與Bcl-2基因相關(guān)的基因,統(tǒng)稱為Bcl-2家族,其基因家族產(chǎn)物包括抗凋亡(Bcl-2、Bcl-x)和促凋亡(Bax、Bad、Bak)2類蛋白.Bcl-2和Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān),Bax表達(dá)增多占優(yōu)勢(shì)時(shí),Bax之間同型二聚體增多,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生.Bcl-2表達(dá)增多時(shí),將阻止Bax之間形成同型二聚體,而形成Bcl-2/Bax二聚體,使細(xì)胞凋亡減少、增殖增加.Bcl-2/Bax蛋白之間的比例,是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素,Bcl-2和Bax協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,影響胃黏膜損傷過(guò)程.本研究發(fā)現(xiàn),PVN微量注射OT后,使GI-R的胃黏膜細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)升高,同時(shí)抑制了Bax的表達(dá).表明PVN微量注射OT通過(guò)抑制Bax的表達(dá),促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),從而減輕GI-R損傷.總之,PVN內(nèi)微量注射OT后,在胃黏膜局部通過(guò)抑制胃黏膜細(xì)胞p-JNK的激活,從而促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),抑制Bax的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對(duì)GI-R胃黏膜的保護(hù)作用.1.2.2pvn內(nèi)微量注射實(shí)驗(yàn)前禁食24h,自由飲水.