動物腸道菌群分子育種研究進展

動物腸道菌群分子育種研究進展

動物腸道菌群的正式研究始于巴斯德（l.paseur）和克里夫（r.koch）對細菌學的研究，提出了必要的消毒和純培養(yǎng)法技術。特別是以柯赫于1881年開創(chuàng)的純培養(yǎng)法為開端,1885年埃希氏由乳兒糞便中分離出大腸埃希菌,才開始了腸道菌群的系統(tǒng)研究。1933年由Eggerth和Gagnon明確了腸道厭氧菌問題,1957年由東德的Haenel、SlanetzandBartley證明了在人、家畜、家禽腸道菌中厭氧菌占95%以上,最優(yōu)勢菌是包括乳桿菌或雙叉桿菌在內的厭氧菌,完全改變了19世紀末認為大腸埃希菌和腸球菌是優(yōu)勢菌的看法。進而指出在腸道菌叢檢查中必須加用高度厭氧培養(yǎng)法和培養(yǎng)基。1969年,B.S.DrasarandMargotShiner大致確立了腸道菌叢檢查法,幾乎所有菌都能用直接涂抹方法培養(yǎng)。以確立這樣的腸道菌叢培養(yǎng)法為開端,開始了對人和動物腸道菌叢的微生態(tài)學研究。到目前為止,腸道菌群結構的分析研究方法主要有以下幾種。1分離培養(yǎng)法對微生物多樣性的分析在DNA分子技術出現之前,人們對腸道菌群的認識大多數是靠純培養(yǎng)或靠直接形態(tài)觀察來獲得部分信息。用純培養(yǎng)方法分析微生物群落結構,就是通過對不同的微生物人為地設計多種適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件盡可能分離樣品中所有微生物,進而對微生物群落結構和微生物的活性進行分析。在最初開始微生物生態(tài)學研究時,如土壤微生物的研究,這種傳統(tǒng)的分離純培養(yǎng)方法用的最多。分離培養(yǎng)技術也分析了人體和動物腸道內定居著的大量微生物。1974年Morre和Holdeman對20例男性的(地理位置上涵蓋了日本到夏威夷)糞便樣中微生物的種類和相對數量通過分離培養(yǎng)法做了統(tǒng)計分析研究,培養(yǎng)得到了1147個純培養(yǎng)物,鑒定為3個不同種的微生物。但這種分離方法,也可能會漏掉那些數量很高,但營養(yǎng)條件要求苛刻的菌。1989年Hirayama等和1988年Zhang等也分別用培養(yǎng)的方法對大熊貓腸道菌群的多樣性進行了調查研究。Zhang等發(fā)現大熊貓腸道內的優(yōu)勢菌群為E.coli而Hirayama等發(fā)現大熊貓腸道內優(yōu)勢菌為Streptococcus和Terobacteriaceaee。事實上,自然界中,很大一部分細菌是不能通過實驗室培養(yǎng)得到純分離物的,原因是有些微生物要求的生長條件苛刻,有些是絕對的嚴格厭氧菌,還有些是在自然環(huán)境中與其他微生物形成共生關系。實驗室很難模擬自然環(huán)境的條件,因而無法得到其純培養(yǎng)物。因此,用這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來研究某一微生物生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性,必然存在著局限性,不能給出一個系統(tǒng)中微生物的全貌。而且腸道內微生物大多都是厭氧菌,若以這部分能夠被分離培養(yǎng)的微生物來代表腸道中復雜的微生物菌群也必將導致極大的偏差。現在很多學者利用分子生物學的手段來研究微生物生態(tài)系統(tǒng),然而,無論分子生物學的手段如何先進,對自然界微生物的研究,最終仍然希望能夠得到盡可能多的純培養(yǎng)物,在種的水平上詳細研究其生理生化特征和功能。2利用菌株的指紋圖譜檢測細菌基因組dna1991年Hulton等首次在E.coli、Salmonellatyphimurium及其他腸道細菌基因組中發(fā)現了ERIC(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus)序列,即腸桿菌基因間保守重復序列。ERIC實際上是一對長度大于16堿基的引物,ERIC-PCR是一種“長引物隨機PCR技術”。同年,Versalovic等發(fā)明針對ERIC序列設計引物并進行PCR擴增的技術,以用于對細菌的基因組DNA進行指紋圖譜分析,并將該技術申報專利。此后,ERIC-PCR技術就被廣泛應用于細菌分類和菌種鑒別上,也被用來設計專一性的探針和引物用于檢測環(huán)境和臨床樣品中目標菌的存在情況。1999年DiGiovanniG.D.等用ERIC-PCR分析6種可培養(yǎng)的純菌組成的混合菌圖譜,獲得了高重復性的指紋圖譜。2003年潘莉等、2004年Wei等、2005年魯海峰等、2007年徐靈筠等以ERIC-PCR指紋圖譜技術為手段,分別對腹瀉兒童、人及仔豬、大熊貓、糖尿病小鼠腸道菌群結構做了比較分析,均獲得了清晰、可重復的圖譜。大量研究結果表明,ERIC-PCR指紋圖譜技術可成功地分析不同腸道菌群的組成并動態(tài)監(jiān)測菌群隨時間或環(huán)境因素影響而變化的過程,具有快速、重復性強、靈敏度高等優(yōu)點,克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法費時、費力、選擇性強的缺點,是對目前已經普遍使用的各種16SrDNA基因多樣性分析方法的必要補充。根據ERIC-PCR指紋圖譜提供的線索,就可以找到一些與功能相關或有特殊生態(tài)意義的DNA片斷,或在此基礎上結合群落分子雜交技術以尋找一些特定微生物群落的“標記序列”。3srrna擴增、克隆及測序16SrDNA的分子測序技術主要包括DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis,變性梯度凝膠電泳),TGGE(溫度梯度凝膠電泳),16SrDNA克隆文庫和16SrDNA高通量測序。3.1快速檢測16srdna的分子分型分子生物學技術的應用克服了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的限制,使得微生物學者可以從基因水平上估計種的豐度、均度,查明種的變異情況等,從而可以客觀的認識微生物天然的生態(tài)狀況。其中PCR-DGGE/TGGE是近幾年在國內外應用比較廣泛的分子技術之一,它是基于16SrDNA的可變區(qū)PCR擴增子的序列特異性變性濃度/溫度不同進行分離的,并且可以檢測出序列中1個核苷酸的差異。因此通過該技術直接擴增16SrDNA的可變區(qū)V3/V6/V8,通過DGGE構建DNA指紋圖譜,建立快速檢測的分子分型平臺,每一個條帶代表某個微生物優(yōu)勢菌群,通過測序和序列比對,可以得出此優(yōu)勢菌群的種類,能檢測到難以或不能培養(yǎng)的微生物,更能精確反映腸道菌群結構的動態(tài)變化。因此廣泛用于腸道復雜微生物區(qū)系菌群結構演替和多樣性分析研究,如對糞便中乳酸桿菌種類的分析,服用不同食物(如藥物、益生素等)后腸道菌群的變化等。3.21srrna測序16SrDNA文庫是16SrDNA這1542個堿基遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中,這個群體就是16SrDNA克隆文庫。一般通過構建λ噬菌體、Cos質粒、YAC人工酵母等方法構建。將16SrDNA基因的擴增和純化后與載體連接,再轉化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞中,通常所構建的文庫只有經藍白斑篩選、菌落PCR和質粒雙酶切鑒定為含有目的基因片段的陽性克隆子才能進行測序。也可以直接采用454平臺對16SrDNA-PCR產物進行高通量測序法。將所測的全部16SrDNA基因序列導入RibosomalDatabaseproject數據庫ChimeraCheekv2.7(/cgis/chimera.cgi?su=SSU)進行序列分析檢測,以去除嵌合和錯誤序列,再去掉序列中的16SrDNA基因引物及其上下游序列之外的序列,去除載體及引物序列的細菌16SrDNA基因序列與GenBank及RDP數據庫中細菌序列進行相似性比較分析,從中得到相似高的序列,以鑒定各測序序列的細菌所屬類型。2009年HusenZhang等將16SrDNA-PCR得到的184094個序列,通過454高通量測序技術對比分析了6個肥胖人和3個正常人的腸道菌群結構差異,系統(tǒng)進化分析表明盡管人的腸道菌結構十分不同,它們的差異主要集中在6大分支3個群尤其是厚壁菌門在正常體重人群中占優(yōu)勢,而肥胖人在其經過胃時極度下降,但變形菌門細菌有一定比例的上升,產氫普雷沃氏菌科在肥胖人體中高度豐富。4熒光原位雜交技術自從1995年PSLangendijk等采用了16SrDNA熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization,FISH)分析了人糞樣中雙歧桿菌的種屬,1998年AHFranks等分析了人糞樣中細菌種群的多樣性之后,2000年AMoter等對熒光原位雜交技術在使微生物群的可視化研究中的作用進行了肯定,該技術不但對可培養(yǎng)微生物且對不可培養(yǎng)微生物也可進行探測。2005年ASwidsinski等采用熒光原位雜交技術分析了小鼠正常和發(fā)炎腸道菌群的空間結構。目前以16SrDNA為靶序列的寡核苷酸探針熒光原位雜交技術已廣泛應用于分析環(huán)境中復雜的微生物群落構成。5宏基因組學的原理雖然16SrDNA雜交或PCR技術被廣泛用于微生物多樣性的研究,但這一技術無法提供腸道中未培養(yǎng)微生物的遺傳、代謝和生理生化等方面的信息,而宏基因組學研究可以彌補上述不足。宏基因組是指樣品中全部微生物的基因組,包含了可培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物基因組,由Handelsman于1998年首次提出。宏基因組學(又叫元基因組學,Metagenomics)就是一種以樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段,以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。在宏基因組學研究中,借助于大規(guī)模測序,結合生物信息學工具,能夠發(fā)現大量過去無法得到的未知微生物新基因或新的基因簇,這對了解胃腸道微生物區(qū)系組成、進化歷程和代謝特點,挖掘具有應用潛力的新基因具有重要意義。2012年QinJ等采用二階段宏基因組關聯研究方法(two-stageMGWAS)通過基因組高通量測序研究了來自中國的345個腸道樣本的微生物基因組和組成差異,找到了2型糖尿病在宏基因組學上的物種分類和基因功能標記約6000個。宏基因組學研究的技術路線見圖1。5.1微生物群體基因的組成及功能宏基因組測序,是對特定環(huán)境(如動物腸道)樣品中的微生物群落基因組進行高通量測序,以分析微生物群體基因組成及功能,解讀微生物群體的多樣性與豐度,探求微生物與環(huán)境、微生物與宿主之間的關系,發(fā)掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因組測序(常用454測序技術)研究避開了微生物分離培養(yǎng)的過程,擴展了微生物資源的利用空間,為微生物的研究提供了有效工具。5.2功能驅動篩選和生物信息分析在宏基因組學的研究程序中很多是采用構建基因組文庫的路線,克隆DNA到合適的載體,如λ噬菌體,Fosmid和BAC(bacterialartificialchromosome),再將載體轉化導入宿主菌體(大腸埃希菌)便建立了其宏基因組文庫。在宏基因組學分析中,靶基因可能只占環(huán)境總基因的很小一部分,因此,必須對樣品或基因采取富集技術,對文庫進行篩選,目前常用的文庫篩選方法是基于功能驅動篩選法和序列驅動篩選法。根據微生物生理和生化特點,可利用選擇性培養(yǎng)基對樣品富集培養(yǎng)?；蚋患塬@得大量高純度DNA,有助于研究特殊微生物群體。如穩(wěn)定同位素探針技術(SIP)已被廣泛應用于研究參與特殊物質代謝的個別群體;抑制性消減雜交法(SSH)可以選擇性的擴增差異表達目的cDNA片段,同時抑制非目的cDNA的擴增;功能驅動篩選能直接獲得生物活性物質,而序列驅動篩選能鑒定酶的可能代替物;底物誘導基因表達(SIGEX)法(Substrate-inducedgene-expressionscreeningmethod)是利用代謝相關基因或酶基因往往在有底物存在的條件下才表達,反之則不表達,這個原理來篩選目的代謝基因。Rees等利用羧甲基纖維素培養(yǎng)基富集培養(yǎng)微生物最終得到了4倍量的纖維素酶基因。Liles等利用16SrDNA探針篩選宏基因組文庫,從中鑒定了大量未培養(yǎng)耐酸性細菌。功能驅動篩選方法是利用離心和選擇性篩選培養(yǎng)基,篩選能分解底物的目標克隆,鑒定其生化和分子生物學特征。序列驅動篩選是依賴于保守序列探針或PCR引物及生物信息學內容進行篩選。利用功能驅動篩選方法已從胃腸道中獲得了多種新的抗生素、新水解酶和多酚氧化酶。高通量測序結果都是用軟件先進行剪輯和歸類,然后在數據庫中比對分析。生物信息分析包括標準信息分析和高級信息分析。標準信息分析要經過:(1)數據處理:去除低質量Reads、去除接頭序列、去宿主污染;(2)組裝:組裝和組裝結果統(tǒng)計、Contigs長度分布統(tǒng)計;(3)樣品復雜度分析:組裝Reads利用率統(tǒng)計、Kmer統(tǒng)計與GC-depth分析、將Reads與已測細菌基因組與GenBank腸道基因集數據庫比對統(tǒng)計,能對序列進行系統(tǒng)分類。MEGAN軟件是目前分析宏基因組數據的有效工具。高級信息分析也要經過3個步驟:(1)物種分類:將測序的Reads比對到已公布的微生物基因組數據庫中,鑒定樣品中微生物的種類分布、統(tǒng)計每個物種分類水平的豐度;(2)功能基因分析:對Contig≥500bp的組裝結果進行基因(ORFs)預測、功能基因注釋與KEGG、eggNOG數據庫比對,統(tǒng)計每個功能集的組成;(3)多樣品間的比較分析:聚類分析(物種、功能)、主成分分析(PCA)、篩選與樣品分組顯著相關的因子(物種、功能)等;(4)定制化信息分析:包括目標物種的高級分析(如高豐度物種、關注物種等);目標物種的功能注釋結果統(tǒng)計;目標基因的高級分析(如高豐度基因、關注基因等);目標基因的物種注釋信息統(tǒng)計;目標基因的KEGG代謝通路分析。16SrDNA測序技術是對16SrDNA的全序列或V3、V6、V8可變區(qū)進行測序分析的,可以達到對菌群結構和系統(tǒng)進化分析的目的,是用于分類研究的,而宏基因組學的方法是對樣品的總DNA直接進行全基因組的宏基因組測序,可以對菌群除了進行分類研究外,