硫酸鹽還原菌的生態(tài)作用

硫酸鹽還原菌的生態(tài)作用

硫酸還原菌（srb）是一種嚴(yán)格的厭氧菌。它被用作有機(jī)化合物化合物的電子受體，并在代謝活動(dòng)中產(chǎn)生高度稀釋的硫酸鈉。硫酸鹽還原菌有著重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境意義。研究表明硫酸鹽還原菌參與有機(jī)物厭氧降解和低硫酸鹽環(huán)境中碳的厭氧礦物化,其產(chǎn)生的H2S除了對(duì)很多微生物和其他生物有毒害作用,也可以作為一些硫代謝細(xì)菌的電子供體;同時(shí)由于硫酸鹽還原菌產(chǎn)生的H2S、代謝過(guò)程中引起油和氣體酸化以及細(xì)菌和FeS對(duì)孔隙的堵塞等原因可造成鋼鐵、金屬等材料的腐蝕,引起工程設(shè)施受損。硫酸鹽還原菌在倍受關(guān)注的甲基汞生物富集過(guò)程中起著重要作用,亦參與環(huán)境甲苯和二甲苯降解以及可溶性鈾和不溶性鈾轉(zhuǎn)化。作為自然界中一類生物,硫酸鹽還原菌是硫化物轉(zhuǎn)化、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中不可缺少的參與者和發(fā)動(dòng)者。隨著環(huán)境中硫酸鹽還原菌研究的深入,要求建立準(zhǔn)確可靠的硫酸鹽還原菌鑒定和微生物群落結(jié)構(gòu)中硫酸鹽還原菌量化分析的方法。本文圍繞著對(duì)硫酸鹽還原菌類群鑒定和量化分析方法作一綜述。1鹽析還原菌的分離純化硫酸鹽還原菌分離純化方法應(yīng)用較多,多采用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng),常用的培養(yǎng)基為RP-38肉湯。硫酸鹽還原菌大部分為中溫性細(xì)菌,最適溫度為30℃,但部分嗜熱菌要求55℃生長(zhǎng),培養(yǎng)時(shí)應(yīng)根據(jù)菌株的溫度型選擇培養(yǎng)溫度。硫酸鹽還原菌在pH5~9.5的范圍內(nèi)生存,最適pH值為7.0~7.8。取自高鹽環(huán)境樣品在進(jìn)行硫酸鹽還原菌培養(yǎng)時(shí),還應(yīng)加入2.5%的NaCl。硫酸鹽還原菌厭氧培養(yǎng)時(shí)所用培養(yǎng)基的氧化還原電位(Eh)要求在-100mV以下,通常添加巰基乙醇或抗壞血酸作為還原劑以獲得較低的氧化還原電位。同時(shí)培養(yǎng)基中加入的亞鐵鹽可以與硫酸鹽還原菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生的H2S形成FeS黑色沉淀,在固體培養(yǎng)基上可形成黑色菌落或菌落周圍形成黑色沉淀環(huán),液體培養(yǎng)基則表現(xiàn)為黑色混濁或沉淀成長(zhǎng)。硫酸鹽還原菌分離純化培養(yǎng)可以得到純化菌株,有利于對(duì)菌株進(jìn)一步分析。但該法只能選擇性地培養(yǎng)出硫酸鹽還原菌某些類群,且分離培養(yǎng)后菌株的生理特性易發(fā)生改變等,有時(shí)并不能說(shuō)明樣品的真實(shí)情況。選擇適宜的培養(yǎng)基、正確的樣品預(yù)處理和嚴(yán)格的厭氧實(shí)驗(yàn)條件是硫酸鹽還原菌分離純化培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵。2ssr-rflp基因及pcr-rflp和原位雜交建立于檢測(cè)硫酸鹽還原菌遺傳標(biāo)記基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)方法主要有PCR、PCR-RFLP和原位雜交,常用的遺傳標(biāo)記主要有硫酸鹽還原菌16SrRNA基因特征序列和硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶(dissimilatorysulfitereductase,dsr)基因。2.1利用16srrna基因分析PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,其目的是將微量DNA大量擴(kuò)增。PCR方法被廣泛應(yīng)用于硫酸鹽還原菌的鑒定和檢測(cè)中,所用引物多是依據(jù)硫酸鹽還原菌6個(gè)主要類群的16SrRNA基因特征性序列而設(shè)計(jì)的,也有利用PCR對(duì)硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶基因分析的報(bào)道,MichaelWagner等對(duì)多種屬于真細(xì)菌和一種屬于古細(xì)菌的硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列分析,并進(jìn)一步推導(dǎo)出亞硫酸鹽異化酶氨基酸序列進(jìn)行比較,結(jié)果表明硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶氨基酸序列有高度相似性(49%~89%),從而推斷出屬于真細(xì)菌和古細(xì)菌的硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶可能起源于同一個(gè)保守的酶。PCR敏感性高、實(shí)驗(yàn)方法較為成熟,近幾年被廣泛應(yīng)用。但如何解決環(huán)境樣品核酸提取和PCR對(duì)混合DNA樣品中某些模板的優(yōu)先擴(kuò)增等問(wèn)題是成功應(yīng)用PCR于硫酸鹽還原菌鑒定和檢測(cè)的關(guān)鍵。2.2利用rflp進(jìn)行基因分析RFLP即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,是根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶具有識(shí)別并切割目的DNA特殊堿基序列的特性,利用特定限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA進(jìn)行消化。由于目的DNA堿基的突變或種屬之間的差異可能會(huì)使酶切位點(diǎn)增加或減少,從而使酶切片斷的數(shù)量和大小發(fā)生改變,可以在一定程度上反映出目的DNA分子的序列信息。得出的限制性酶譜亦可以與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較,進(jìn)行微生物的鑒定。RFLP常和PCR合用,利用RFLP對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化,即所謂的PCR-RFLP。常選用硫酸鹽還原菌SRB385基因片段和dsrAB基因片段進(jìn)行PCR-RFLP,來(lái)進(jìn)行硫酸鹽還原菌特定基因的多態(tài)性分析或類群鑒定。SRB385基因是δ群變形桿菌綱的微生物(包含大多數(shù)硫酸鹽還原菌)16SrRNA基因385~402bp保守核酸序列,依據(jù)該基因建立的分子生物學(xué)方法所檢測(cè)的微生物常特指硫酸鹽還原菌所有類群。dsrAB基因編碼硫酸鹽還原菌亞硫酸鹽異化酶,同一類群的硫酸鹽還原菌中相當(dāng)保守,在不同類群中卻有較大差別,可以作為硫酸鹽還原菌的分類與進(jìn)化的指標(biāo)。XueduanLiu等利用PCR-RFLP分析了東太平洋海洋沉積物中的硫酸鹽還原菌dsrAB基因多態(tài)性,表明該基因的分子多態(tài)性即硫酸鹽還原菌類群多態(tài)性與海洋的深度、碳源生物利用度密切相關(guān)。PCR-RFLP有很高的分辨率,結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性也較高;不足之處是操作步驟繁瑣,有較高的技術(shù)要求。2.3細(xì)胞原位雜交核酸分子雜交技術(shù)是利用特異性探針對(duì)微生物的核酸序列進(jìn)行檢測(cè),從而分析微生物群落結(jié)構(gòu)、分布模式、豐度和特定微生物類群。雜交所用的探針多采用依賴16SrRNA序列設(shè)計(jì)的寡核酸探針,雜交方式通常有菌落雜交、斑點(diǎn)印跡雜交和原位雜交,以斑點(diǎn)印跡雜交和原位雜交較為常用。斑點(diǎn)印跡雜交(dotblothybridization)通常是提取并點(diǎn)樣于濾膜上的微生物16SrRNA與標(biāo)記探針雜交,從而進(jìn)行定性和定量分析。定量斑點(diǎn)印跡雜交檢測(cè)過(guò)程中常應(yīng)用2種以上寡核苷酸探針,分別是測(cè)定所有微生物的通用寡核苷酸探針和特定微生物的特異性寡核苷酸探針。樣品雜交后信號(hào)強(qiáng)度與定量培養(yǎng)物制備的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,可以將測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞數(shù)。該法已被應(yīng)用于硫酸鹽還原菌定量檢測(cè)中。定量斑點(diǎn)印跡雜交所用的探針常以放射性核素進(jìn)行標(biāo)記,具有較高的敏感性;同時(shí)16SrRNA是細(xì)胞內(nèi)的可測(cè)產(chǎn)物,其含量可以代表特定微生物群體的生理活性。但不同種的微生物體內(nèi)含有不同數(shù)目的核糖體(103~104),甚至是同一菌株在不同的生長(zhǎng)階段其核糖體含量也不相同,使該方法在運(yùn)用中存在一定的問(wèn)題。目前應(yīng)用較多的核酸雜交技術(shù)是原位雜交技術(shù)(insituhybridization),這里的原位雜交技術(shù)是指不改變細(xì)胞形態(tài)和微生物小環(huán)境進(jìn)行的雜交。利用rRNA序列探針進(jìn)行原位雜交,最早的標(biāo)記物是核素,該方法需要較長(zhǎng)時(shí)間的曝光和環(huán)境的污染。近幾年熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針被廣泛應(yīng)用于原位雜交中,即所謂的熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)。該法是通過(guò)熒關(guān)素標(biāo)記依據(jù)rRNA(主要是16SrRNA)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針,后者與固定在玻片或纖維膜上的組織或細(xì)胞中特定的核苷酸序列進(jìn)行雜交,結(jié)果可直接在熒光顯微鏡下觀察。近幾年有了很多的根據(jù)16SrRNA設(shè)計(jì)的群和屬的寡核苷酸探針進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和硫酸鹽還原菌類群的分析。EnricLlobet-Brossa利用氰鹽(Cy3)標(biāo)記特異性寡核苷酸探針的熒光原位雜交,研究了德國(guó)北海WaddenSea沉積物不同垂直度的微生物群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明一定垂直度的沉積物中,硫酸鹽還原菌占總微生物的量?jī)H次于黃桿菌屬。原位雜交技術(shù)不僅可以量化樣品中的硫酸鹽還原菌,而且還可以分析硫酸鹽還原菌在樣品中的空間分布和動(dòng)態(tài)變化。該方法也存在著一定的缺點(diǎn),首先是敏感性較低,硫酸鹽還原菌小于103/cm2時(shí),視野下檢測(cè)信號(hào)就較少。對(duì)于這樣的標(biāo)本通常使用過(guò)濾的方法,對(duì)微生物進(jìn)行富集;其次是低信號(hào)強(qiáng)度時(shí)待檢測(cè)的目的分子較少,有增加探針?lè)翘禺愋噪s交的可能性;此外,不同生長(zhǎng)階段的微生物細(xì)胞內(nèi)的rRNA含量也不同,造成了同種細(xì)菌的信號(hào)強(qiáng)度不同。3熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)基于生物特征化合物的測(cè)定方法主要有微生物多胺法、生物醌圖譜法和免疫標(biāo)記法等。以免疫標(biāo)記法較為常用,標(biāo)記物常為熒光素和酶。硫酸鹽還原菌鑒定和分析方法主要有直接熒光抗體法(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。前者利用熒光標(biāo)記的特異性抗體即所謂的免疫熒光探針,對(duì)硫酸鹽還原菌菌體表面或菌體內(nèi)特異性抗原進(jìn)行定性或定量檢測(cè);同時(shí)免疫熒光探針可以產(chǎn)生很好的空間定位,可以通過(guò)熒光顯微鏡分析樣品中硫酸鹽還原菌的空間位置。后者是基于檢測(cè)硫酸鹽還原菌菌體中的腺苷酰硫酸還原酶(adenosine-5′-phosphosulfatereductase,APSreductase)的理論建立起來(lái)的一類方法。生物特征化合物的檢測(cè)方法最小檢測(cè)限度為103~104cell/cm3,限制了硫酸鹽還原菌較低濃度標(biāo)本的檢測(cè);同時(shí)由于標(biāo)本中硫酸鹽還原菌殘片可以作為游離抗原,對(duì)IFA檢測(cè)方法造成干擾;其他種屬的細(xì)菌體內(nèi)也有腺苷酰硫酸還原酶的存在,降低了檢測(cè)該酶的ELISA方法特異性。4菌株的進(jìn)一步分析對(duì)環(huán)境