腸道埃希氏菌檢測方法的研究進展

腸道埃希氏菌檢測方法的研究進展

此外，通常被稱為e.coli的腸球菌科和屬于e.koli的細菌。與人類疾病有關的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌(此名稱不易與致病性大腸桿菌相混淆),一般包括五種,即腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)、侵襲性大腸桿菌(EIEC)和粘附性大腸桿菌(EAEC)。由于E.coli是人及各種動物腸道中的正常寄居菌,常隨糞便從人及動物體排出,廣泛散播于自然環(huán)境中,所以一旦檢出E.coli,即意味著直接或間接地被糞便污染。在衛(wèi)生學上,E.coli被用作飲水、食品等的糞源性污染衛(wèi)生細菌學指標;E.coli在外界存活時間與一些主要腸道病原菌相近,它的出現(xiàn)也可能預示著某些腸道病原菌(例如沙門氏菌、志賀氏菌)的存在,因此它是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來,有些國家在制定HACCP標準時,將E.coli作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。1e.coli檢測一般情況下,食物和水中E.coli的檢測是以生長培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵、產氣和形成吲哚為基礎。很多年來MPN(MostProbableNumber,最大可能數(shù))法一直作為E.coli檢測的典型方法,需要6～7d的檢測時間,時間太長,已不能適應現(xiàn)代化品質管理的原則,而且超過18～24h的培養(yǎng)期,許多易腐敗即食性產品早已上市或完成消費行為,因此,E.coli的快速檢測對于生產實踐具有重要意義。1.1檢測細胞的活性直接平板法和疏水柵膜過濾法(HGMF)在標準MPN法的基礎上進行了重大的改進。HGMF法是將預過濾的食物樣品用由疏水材料制成的柵格膜過濾器過濾,然后將濾膜在胰蛋白胨豆胨瓊脂上44.5℃培養(yǎng)4h后,再在胰蛋白胨膽汁瓊脂上44.5℃培養(yǎng)18～24h,最后用吲哚試劑處理后對粉紅色菌落進行計數(shù)。這種方法主要的優(yōu)點是可以去除食物樣品中的E.coli抑制物和其它一些不想要的物質,并可將微生物進行濃縮。然而它只能檢測E.coliⅠ菌,不能檢出E.coliⅡ菌,并且HGMF過濾器的價格要比其他膜過濾器貴的多,在過濾前還需要進行酶處理,所以它的應用受到了限制。1.2其他常用檢測底物研究表明,94%～97%的E.coli具有β-D-葡糖醛酸糖苷酶(β-D-glucuronidase簡稱GUS)活性,而且?guī)缀跏称泛退兴衅渌哪c桿菌缺乏這種酶,因此,以此為基礎的食物和水中E.coli的檢測方法得到了快速發(fā)展。GUS是一種水解酶,可催化β-D-吡喃葡糖分解為苷元和D-葡糖醛酸,pH5.0～7.5時都很穩(wěn)定,最適pH為6～7,并且在53℃時仍有活力。據(jù)報道,E.coli的GUS是由uid4基因編碼的誘導酶,分子量大約為260,000～290,000Da,由四個亞單位組成,每個亞單位的分子量約為74,00ODa。通過使用不同的顯色和熒光底物,用比色法或熒光法可檢測GUS活性。MUG是最常用于GUS檢測的熒光底物,它是水溶性的,具有高度的特異性和敏感性,可以加到固體或液體的選擇培養(yǎng)基中,而且它還可以和培養(yǎng)基一起滅菌而不影響它的活性,當它的濃度小于200μg/mL時對E.coli沒有抑制作用。LST-MUG法已得到廣泛的應用,如用于冷卻或冷凍食品中E.coli的檢測。近年來有人研究了化學發(fā)光檢測E.coli的方法,化學發(fā)光法是以檢測E.coli生成的GUS分解發(fā)光底物產生的光為基礎的檢測方法,主要以1,2-環(huán)氧乙烷衍生物為底物。1995年S.O.VANPOUCKE等人比較了化學發(fā)光法、熒光法、比色法檢測大腸菌群的β-D-半乳糖苷酶的敏感度。研究證實,使用化學發(fā)光法縮短了檢測時間,提高了檢測的敏感度,它的敏感度約為熒光法和比色法的4倍和1000倍。化學發(fā)光分析檢測酶底物不使用任何光源,避免了背景光和雜散光的干擾,降低了噪聲,大大提高了信躁比,因而,化學發(fā)光分析法一般都有很高的靈敏度,通?？蓽y定納克級或皮克級的化學組分。2000年S.O.VANPOUCKE等人又進行了進一步的研究,將細菌的增殖培養(yǎng)、目標酶的誘導過程與酶、底物作用過程分離,并加入多粘菌素B促進底物的吸收,然后將這一方法與不同的檢測設備,如紫外燈、X光片、CCD相機和固相細胞計數(shù)儀進行比較,結果證實使用固相細胞計數(shù)儀更加方便靈活,在4h內即可得出定量檢測結果。檢測β-D-葡萄糖苷酸酶的常用底物見表1。目前已經(jīng)研制出了快速檢測GUS活性的試劑盒,美國FDA認可的幾種已經(jīng)商品化的檢測法見表2。除了E.coli腸桿菌科其它的菌屬也會產生β-D-葡糖醛酸糖苷酶,如志賀氏菌、沙門氏菌等,耶爾森氏鼠疫桿菌、梭菌等產β-D-葡糖醛酸糖苷酶也有報導。當非目標菌,如一些革蘭氏陰性菌的GUS活力低時,如果樣品中這些菌濃度小于107～108cfu/mL就可以忽視它們的干擾。然而當非目標菌中含有一些GUS活力高的菌時(如腸球菌等),如果這些菌濃度與E.coli相近那么就會對檢測產生干擾。腸出血性大腸桿菌O157:H7(enterohaenorrhagicE.coliO157:H7,EHECO157:H7)雖然有uidA基因,但不具有GUS活性,因而在使用以GUS為基礎的E.coli檢測方法時可能會產生假陰性反應。1.3標記監(jiān)管系統(tǒng)檢測coli近年來還研究了以微生物代謝活性為基礎的檢測方法,如在微生物的生長和代謝過程中用14C標記碳水化合物測量釋放的CO2。使用這種放射方法經(jīng)過6h的培養(yǎng)后就可檢出1mL水中1～10個E.coli如果將放射性檢測和膜過濾技術結合起來,4.5h的培養(yǎng)就可得到檢測結果。雖然這種方法的檢測速度很快,但由于放射性標記的使用在食品工業(yè)中還不能廣泛的應用。1.4抗凝劑分析法電阻抗簡稱阻抗,是交流電通過導體時遇到的一種抵抗力,它類似于直流電路里的電阻。當細菌在培養(yǎng)基內生產繁殖時,培養(yǎng)基內的營養(yǎng)成分由于細菌的代謝作用轉化為終產物,使培養(yǎng)基中電導性增高,而電阻抗隨之降低。因此,測量培養(yǎng)基內阻抗的變化就可反映培養(yǎng)基內微生物的代謝活性。在某些測定實例中,當細菌產生的細菌濃度達到比培養(yǎng)基初始離子濃度稍低的含量時,電導改變即可檢出,這一時間稱作微生物閾值(DT)。由于微生物在培養(yǎng)基中可產生具有特征性的阻抗,不同微生物在培養(yǎng)基中的代謝活性各不相同,這就成為利用阻抗法進行微生物研究的可靠依據(jù)。在阻抗法中,最主要的是建立說明阻抗測定時間DT與平板細菌計數(shù)之間關系的標準曲線和方程,曲線建立后,待測的樣品可在測定阻抗檢測時間DT后帶入方程式,就可直接估算出細菌總數(shù)。J.Dupont等使用阻抗法定量檢測了活的貝殼類動物中E.coli的數(shù)量并與傳統(tǒng)的MPN法進行比較,阻抗法在5～9h內就可獲得使用MPN法3d才能得到的結果。電阻抗測量法采用電阻抗測試儀與電子計算機聯(lián)用,具有操作簡單、快速測量、可連續(xù)采樣測量培養(yǎng)基中活菌生長狀況,且可測量多份樣品、自動化程度高等優(yōu)點。但該法具有花費高,當樣品起始污染量低時檢出時間較長,而且特異性和選擇性受到限制的缺點。1.5e.coli的測定近年來以核酸為基礎的檢測方法越來越多,例如DNA雜交、聚合酶鏈反應(PCR)。DNA探針用放射性物質或酶標記,然后與樣品DNA提取物共同培養(yǎng),添加底物后由產生的熒光、化學發(fā)光或彩色沉淀物判定E.coli的檢出。DNA雜交法具有高度的特異性,但它要求的菌體細胞數(shù)水平也要高,達到104-105/～mL,因而培養(yǎng)時間較長,不適合快速檢測。1.5.1pcr法檢測3fmPCR技術是1985年Cetrus公司發(fā)展起來的一種快速離體擴增特定DNA片段的專利技術,曾于1989年被美國Science雜志列為10項重大科學發(fā)明之首,為80年代分子生物學領域的一項革命性突破。PCR通過分別與雙鏈目的DNA序列兩個3′端互補的寡核苷酸引物,由熱穩(wěn)定的TagDNA聚合酶從5′到3′進行一系列的DNA聚合反應,可在幾小時內獲得擴增幾百萬倍的目的DNA,這樣大量的PCR產物很易于被檢測和鑒定。PCR法能夠成指數(shù)的擴張DNA,因此,即使只有幾個細胞存在也可以進行檢測,食物樣品過夜培養(yǎng)后2h即可檢出25g樣品中的3CFU。近年來在傳統(tǒng)的基礎上發(fā)明了各種PCR法,如多重PCR、實時PCR、定量PCR等。2000年Nathalie等人將實時PCR與分子信號結合使用檢測腸出血性大腸桿菌EHECO157:H7,這種方法可專門用來對污染的牛奶和蘋果汁進行檢測。同年WENLILI等人又研究了一種定量競爭性PCR檢測法。2001年又有多重實時PCR檢測方法的研究報道。2003年K.A.Fode-Vaughan等人發(fā)明了一種直接PCR方法,這種方法,樣品不需處理可直接作為PCR檢測,提供了一種可以更快速的檢測方法。同年AndreasH.等人研究了根據(jù)uidA基因序列變化檢測部分序列從而進行E.coli檢測和辨別的變性梯度凝膠電泳PCR法,這種方法在進行淡水樣品中的E.coli時不需要純化和鑒別培養(yǎng)的步驟,而且能夠得到E.coli特異的指紋圖譜,但是不同來源混合型的大腸桿菌檢測仍需要進一步研究。1.5.2以大腸桿菌16srrna擴增為靶目標的分離系統(tǒng)2000年HenrikStender等人使用化學發(fā)光原位雜交法(chemiluminescentinsituhybridization,CISH)對城市用水進行了E.coli的快速檢測、鑒別和計數(shù)研究。研究表明,經(jīng)過濾和35℃5h的培養(yǎng),使用大豆過氧化物酶標記的肽核苷酸(peptidenucleicacid,PNA)探針以大腸桿菌16SrRNA特異序列為靶目標即可檢測47mm濾膜上的大腸桿菌的單個細胞。化學發(fā)光原位雜交法將傳統(tǒng)的膜過濾核培養(yǎng)技術與PNACISH相結合,提高了PNA探針的特異性和敏感性,從而能夠更快更準確的獲得結果,然而,由于不存在100%的大腸桿菌特異的16SrRNA靶序列(大腸桿菌16SrRNA序列與致賀氏菌相同),以及雜交錯配的影響,這種方法的應用還需要進一步研究。雖然以核酸為檢測基礎的方法敏感度和特異性高,但這些方法由于許多食物組分的抑制作用,仍然需要預富集步驟,而且這種方法不能區(qū)分活的和死的菌體,可能會使測得的菌數(shù)比實際菌數(shù)偏高。1.6e.coli的鑒定免疫化學檢測法在食品科學中有著廣泛的應用。免疫化學法是以抗原和抗體的非共價偶聯(lián)為基礎,包括凝膠、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附、熒光免疫等檢測法。這種方法涉及菌體細胞經(jīng)由固體表面的固定化單克隆或多克隆抗體濃縮過程,然后將結合后的菌體細胞用第二個標記抗體處理,并通過顏色、化學發(fā)光或熒光的變化來控制陽性反應。但是由于經(jīng)濟原因,以及免疫學鑒別E.coli的復雜性,這種方法的利用受到了限制。2000年Caruso等人報道了使用間接免疫熒光顯微鏡對海水樣品中E.coli進行檢測和計數(shù)的方法,他們使用抗不同大腸桿菌血清型的抗血清混合物進行檢測,實驗結果顯示免疫熒光法與標準培養(yǎng)法之間的相關性很高,而且檢測限達到100個細胞/100mL。1.7信號轉換檢測目前E.coli的檢測還涉及到了生物傳感器的使用。生物傳感器是將生物化學傳感同電子信號轉換技術相結合的一種測量系統(tǒng),由分子識別和信號轉換部分組成,其中分子識別部分由對物質具有選擇性識別功能的酶、微生物、抗原或抗體等生物相關物質組成;信號轉換部分由電化學裝置、熱檢測裝置、光檢測裝置等組成,其作用時將生物相關物質同被檢測物質發(fā)生化學反應時所產生的各種變化轉換成電信號。它具有許多優(yōu)點,如高選擇性、高靈敏度、較好的穩(wěn)定性、低成本、能在復雜的體系中進行快速在線連續(xù)監(jiān)測。1995年Bouvrette等人研究了流動注射分析免疫傳感器(flowinjectionanalysisimmunosensor,FIA)用來檢測食品中的E.coli。2000年McEntegart等人發(fā)明了以