基于IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測序的里氏擬石磺的微衛(wèi)星

基金項目：國家自然科學基金（No.41276157），上海高校水產(chǎn)學一流學科建設項目資助。

吳欣（1990-）男，河南人，碩士研究生，主要從事海洋貝類分子標記開發(fā)，E-mail:

wuxin2009001@163.com

沈和定，通訊作者，（1964-）男，上海人，教授，博士，主要從事海洋生物學研究，E-mail:

hdshen@基于IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測序的里氏擬石磺SSR標記開發(fā)吳欣，沈和定*，王冬鳳，劉宸，楊鐵柱，刁亞（上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室201306）摘要：使用IlluminaHiseqTM2000高通量測序技術對里氏擬石磺進行轉(zhuǎn)錄組測序，以所得的拼接序列為基礎，利用MISA和SSRHunter1.3軟件進行微衛(wèi)星序列的查找，對選出的51個微衛(wèi)星位點進行引物設計，經(jīng)PCR擴增得到單一清晰擴增條帶的位點24個，對湛江里氏擬石磺群體擴增結(jié)果表明，其中14個位點表現(xiàn)多態(tài)性。14個多態(tài)性位點得到的等位基因數(shù)在2-4之間，其中觀測雜合度（HoO）和期望雜合度（HeE）分別在0.0313-0.7143和0.0313-0.7084之間，多態(tài)性信息含量（PIC）在0.0895-0.6405之間，14個位點中的2個位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），另外2個位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25）。經(jīng)SequentialBonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡檢驗，9個位點不偏離平衡（P>0.05）。開發(fā)的SSR標記可用于里氏擬石磺群體遺傳學和石磺科貝類間的系統(tǒng)發(fā)生的研究，并為里氏擬石磺的群體種質(zhì)保護提供數(shù)據(jù)支持。關鍵詞：里氏擬石磺，轉(zhuǎn)錄組，微衛(wèi)星標記石磺是軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、石磺總科(Onchidioidea)、石磺科(Onchidiidae)的一群貝類，主要分布于熱帶或亞熱帶地區(qū)的海岸，灘涂、巖礁，紅樹林、潮間帶地區(qū)，是海洋與陸地的過渡帶生物[1-2]。我國的石磺主要分布在東南沿海的潮間帶高潮區(qū)，已報道易采集的主要有4種，包括瘤背石磺（Onchidiumstruma）、平疣桑葚石磺(Platevindexmortoni)、紫色疣石磺(Peroniaverruculata)、里氏擬石磺(Paraoncidiumreevesii)，學者對于石磺的研究主要集中在瘤背石磺，對后3種研究報道較少。其中，對于里氏擬石磺的研究主要集中在形態(tài)學[1-3]、化學成分測定[4-6]、線粒體基因組及群體多樣性的分析[7-9]幾個方面，未見利用分子標記研究其遺傳多樣性的報道。微衛(wèi)星，又稱簡單重復序列(SSR)[10]，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點特異性、檢測方便和呈共顯性遺傳等特點，在水產(chǎn)動物中主要用于遺傳連鎖圖譜的制備、性狀分析、QTL定位、群體遺傳學、進化遺傳、種質(zhì)鑒定與親權(quán)分析、品種培育等方面[11]。里氏擬石磺作為海洋向陸地進化的過渡物種之一，在研究海洋無脊椎動物向陸地進化延伸中具有重要作用[12-13]，本研究利用IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測序?qū)锸蠑M石磺進行微衛(wèi)星（SSR）分子標記開發(fā)，為研究其群體遺傳學和石磺科不同種貝類間的系統(tǒng)發(fā)生提供基礎數(shù)據(jù)。1材料和方法：實驗材料實驗材料于2015年5月采自廣東湛江海灘，共37個，樣本經(jīng)鑒定后均保存于95%無水乙醇并置于-20℃冰箱中備用。實驗方法1.2.1里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果隨機挑選6只于2012年10月采自湛江的里氏擬石磺個體進行活體解剖，將解剖得到的不同組織保存于RNAlater（Qiagen:76104）中用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫并送晶能公司（GenergyBiotechnology）進行IlluminaHiseqTM2000雙末端測序及生物信息學分析，共獲得原始數(shù)據(jù)9.161Gb，有效數(shù)據(jù)8.617Gb。通過denovo拼接獲得了長度大于100bp的轉(zhuǎn)錄物233636條；UnigeneN50長度485bp，經(jīng)GO注釋分析有124598(53.33%)條歸入生物學過程，51891(22.21%)條歸入分子功能，57136(24.46%)條歸入細胞組分，對大于200bp的拼接序列與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對，22558條序列得到蛋白注釋，匹配蛋白數(shù)目為2910個，對注釋后的數(shù)據(jù)進行分析，共涉及物質(zhì)及能量代謝、信號傳導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及免疫應答等諸多生理生化過程。1.2.2微衛(wèi)星序列的來源根據(jù)晶能公司（GenergyBiotechnology）基于IlluminaHiseqTM2000測序平臺所得的拼接序列，經(jīng)MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對微衛(wèi)星位點進行分析，對于非混合型位點篩選時，設置條件為單堿基重復至少10次，二堿基重復至少6次，3-6堿基重復至少5次，在此基礎上，如同一序列中兩個SSR位點間離小于50bp，則認為這兩個SSR位點組成一個混合型SSR位點，在設計引物前利用SSRHunter1.3[14]對經(jīng)MISA篩選過的含有微衛(wèi)星位點的序列進行再次篩選，保證序列的前后側(cè)翼有足夠的長度用于設計引物，篩選條件和第一次一樣，最終篩選出51條含有微衛(wèi)星位點并適合設計引物的序列。1.2.3SSR引物設計與合成利用PrimerPremier5.0(/)軟件對上一步所得的51條拼接序列進行引物設計，引物長度為19—26bp,GC含量在40%—60%之間，也可放寬至30%—70%，引物Tm值小于72°C，且上下游引物Tm值差別不能大于2℃，擴增引物長度在100—300bp，所設計引物在側(cè)翼保守序列內(nèi)。本實驗共設計51對引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.4樣品DNA的提取取出之前保存于-20℃冰箱樣品，根據(jù)使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物基因組提取試劑盒（DP324）的要求，在每只樣品腹足處各取30mg組織塊對所需樣品的用于DNA進行提取，提取后的DNA置于-20℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?.2.5PCR擴增及產(chǎn)物檢測PCR反應體系為10μL，包括上下游引物各0.3μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O4μL，DNA模板0.4μL。PCR反應條件為：94°C預變性5分鐘；94°C30s，退火30s，72°C30s，共40個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。產(chǎn)物保存于4°C。引物初篩PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Godview染色，電泳條件為：115V，35min，電泳緩沖液為1×TAE，凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物進行群體檢測時，PCR擴增產(chǎn)產(chǎn)物8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，電泳條件為：電壓110V，電泳時間6h，電泳緩沖液為1×TBE；電泳結(jié)束后用硝酸銀對凝膠染色并使用相機進行拍照。1.2.6里氏擬石磺SSR引物的篩選及群體檢測隨機選取5個里氏擬石磺個體，提取其DNA并將其混合作為引物特異性和最適退火溫度篩選時的模板DNA，根據(jù)每對引物的Tm值設置間隔為1.5°C的溫度梯度，共設置8個溫度梯度，用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增清晰，條帶單一的引物留用，確定每對引物的最適退火溫度，以便進行后續(xù)檢測。選取32個湛江群體的里氏擬石磺個體，提取DNA，并作為模板，使用初篩后留用的引物進行PCR擴增，PCR反應條件及產(chǎn)物檢測方法遵照上述方法，并對產(chǎn)物進行拍照留存。1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析對湛江群體里氏擬石磺的PCR擴增結(jié)果進行統(tǒng)計時，將每個位點的擴增條帶按從小到大的順序標記為A，B，C…，并統(tǒng)計出每個位點在進行群體檢測時的基因型，根據(jù)結(jié)果，使用Cervus3.0[15]軟件計算每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)（numberofallele,Na），觀測雜合度（observedheterozygosity,HoO），期望雜合度（expectedheterozygosity,HeE），多態(tài)性信息含量（polymorphicinformationcontent,PIC），使用Genepop4.2[16]進行每個位點的Hardy–Weinberg平衡的檢測。2結(jié)果分析2.1轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的軟件分析結(jié)果利用MISA軟件在里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組中查找SSR位點的結(jié)果，如表1所示。表1SSR分析結(jié)果table1OutputstatisticsofSSRSSR標記重復類型拼接序列個數(shù)RepeatmotifofSSRsNumbersofcontig查找到的SSR總個數(shù)67696TotalnumberofidentifiedSSRs含有SSR位點序列個數(shù)46164ThenumberofsequencescontainingSSRs含有多于1個SSR位點的序列數(shù)14423Numberofsequencescontainingmorethan1SSR單堿基型SSR個數(shù)53948Thenumberofmono-nucleotideSSR雙堿基型SSR個數(shù)7577Thenumberofdi-nucleotidesSSRs3堿基型SSR個數(shù)4579Thenumberoftri-nucleotidesSSRs4堿基型SSR個數(shù)1572Thenumberoftetra-nucleotidesSSRs5堿基型SSR個數(shù)14Thenumberofpenta-nucleotidesSSRs6堿基型SSR個數(shù)6Thenumberofhexa-nucleotidesSSRs2.2里氏擬石磺SSR篩選結(jié)果51對引物在經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳的初篩之后有24對擴增出清晰單一的條帶，擴增率為47％。將這些擴增出清晰單一條帶的24對引物在采自湛江群體的36個里氏擬石磺個體做進一步篩選，有14個位點表現(xiàn)為多態(tài)性，其余位點表現(xiàn)為單態(tài)性。在表現(xiàn)出多態(tài)性的14個位點中，7個位點的等位基因為4，4個位點的等位基因為3，3個位點表現(xiàn)為2等位基因。14個位點中，1個位點為五堿基重復，2個位點為四堿基重復，11個位點為三堿基重復，且四，五堿基重復的次數(shù)均為5，三堿基的重復次數(shù)均為6。14對引物中最低退火溫度為50.5°C最高退火溫度為61°C，擴增片段的長度在90—370bp之間。2.3里氏擬石磺湛江群體遺傳多樣性分析對14對SSR引物在取自湛江群體的32個體擴增片段進行統(tǒng)計分析，14個位點的等位基因數(shù)在2—4之間，其中觀測雜合度（HoO）和期望雜合度（HeE）分別在0.0313-0.7143和0.0313-0.7084之間，多態(tài)性信息含量（PIC）在0.0895-0.6405之間，其中2個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），2個位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25）。經(jīng)SequentialBonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡檢驗，9個位點不偏離平衡（P>0.05），其余位點均顯著偏離平衡（0.05>P）（表2）。3討論和結(jié)論SSR是一種應用廣泛的分子標記，利用高通量測序技術對里氏擬石磺進行微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)不僅比傳統(tǒng)方法更為快捷，花費更少，而且在獲得微衛(wèi)星位點的同時可以查找對應EST序列的功能性狀，與基因關聯(lián)性較強。相比于基因組SSR，基于轉(zhuǎn)錄組EST序列開發(fā)的SSR多態(tài)性較低[17]，本實驗共獲得14個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，其中2個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），2個位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25），這表明湛江里氏擬石磺野生群體的遺傳多態(tài)性處于中度多態(tài)性水平。14個位點中有5個位點偏離平衡（P<0.05），可能的原因是種群中有個體產(chǎn)生基因漂變，或者出現(xiàn)了無效等位基因[18]。作為海洋無脊椎動物向陸地延伸的過渡物種，石磺科貝類認為是研究海洋貝類向陸地輻射生活的最好代表。而利用微衛(wèi)星分子標記作為研究水產(chǎn)動物的系統(tǒng)進化已經(jīng)得到廣泛引用，汪桂玲[19]等曾利用微衛(wèi)星分析五大湖野生三角帆蚌群體的遺傳多樣性和種間發(fā)生關系；董秋芬[20]等利用13個微衛(wèi)星位點對9種石斑魚的種系發(fā)生關系進行研究；這些都為利用SSR標記研究石磺科貝類間種系發(fā)生提供了借鑒。本研究中利用高通量測序技術開發(fā)的14個微衛(wèi)星位點，不僅為研究里氏擬石磺的遺傳多樣性提供了基礎數(shù)據(jù)，也可用于石磺科貝類間種系發(fā)生關系的研究中。表214對SSR引物在32個里氏擬石磺擴增特性的描述Table2Primersequencesandcharacterizationof14polymorphicmicrosatellitelociin32ParaoncidiumreevesiiLocusPrimers:（5’→3’）RepeatmotifTa(°C)Sizerange(bp)NaHoOHeEPICPvalueHWEPR4F:CTTGTTACACCCCGCTCCC(GCCCT)56090-10040.71430.70840.64050.0349R:CTGTGACATAATCAATGCTGCTCTPR5F:TGATGCGTCAATACAAGGGTG(ATGC)550.5172-18530.37500.32290.28881.0000R:AGTTCGGAGTGCGGAATGGTPR6F:AGTTACAGGTCCAGACAATG(AATA)556.3250-27520.69440.50350.37330.0408R:CTAAGACGGCAATCCAATACPR9F:TAAAGAAGACAGAAACAGGCAACA(ATC)661128-16140.40630.35660.33331.0000R:CAACGGTCATAAAGACTAAAGGAATPR10F:TCTGCTGAACTTGCCATTGT(ATT)657131-15040.39290.34680.32271.0000R:TCCTCTACCAGGGCTCAAAGPR12F:TCCACCTTCTTTATTACCACCC(TAT)656122-13620.03130.03130.03031.0000R:GCCACGCAGTATTGATTGTTPR14F:TTCTTCTTCAGGGAGGTAAA(CAT)655161-19330.44440.55240.44080.1739R:TCAAGTTCTTCATTCGGTTCPR18F:TGTTGGTTGCCTGCCTTTCA(GTA)656150-16220.32140.49290.36690.1125R:ATCGGCTGGCTTGCCTGTTCPR20F:CTGTCTGTTTGGCTGTGATG(TTG)653185-28040.43750.41720.38010.0555R:AATGAAGTCTTGGGTAGATGAAPR22F:GACAAACGACGAGCGACAAA(TGC)652120-19530.45830.54960.48020.3018R:TGGAAGAAGGACAAGGAGGAGTAPR28F:GGTCCCTCTGTGGATTTGGT(GAT)656195-27040.61290.61710.53150.0459R:AAGGATTCTGGCTTCGGTGAPR37F:CATTCGCCCTCTGTTCTATCC(ATC)661260-37030.43330.36550.32621.0000R:TGTCAAACGGTGCTTCTCCTAPR46F:ATAATGATGCTGGAACTGAT(ATT)652250-30040.62500.46730.37990.0304R:AGGATAACAAACTGGGACTTPR50F:TCGGGTTTCCTTGTCTTGTA(ATT)658102-17540.06250.09230.08950.0469R:ATCTCCATCACCTTGGCAGTLocus：位點；Ta：退火溫度，Annealingtemperature；Na：等位基因數(shù)numbersofalleles；HOHo：觀測雜合度observedheterozygosity；HEHe：期望雜合度expectedheterozygosity；PIC：多態(tài)性信息含量polymorphicinformationcontent；Pvalue：P值thetestfordeviationfromHWE參考文獻（References）：[1]吳旭峰,沈和定,吳文健,等.我國華東沿海4種石磺形態(tài)學比較[J].動物學雜志,2010,06:92-100.[2]BouchetP,RocroiJ.Classificationandnomenclatorofgastropodfamilies[M].47ed.InstituteofMalacology,2005.[3]王冬鳳,沈和定,吳欣.石磺科3種貝類皮膚顯微結(jié)構(gòu)比較[J].動物學雜志,2015,50(3):437-444.[4]黃金田,王愛民.瘤背石磺營養(yǎng)成分分析及品質(zhì)評價[J].海洋科學,2008,32(11):29-35.[5]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.四種石磺科貝類的膽甾醇含量測定[J].海洋科學,2015,39(1):24-28.[6]SunB,ShenH,WuH,etal.DeterminationofChemicalConstituentsoftheMarinePulmonateSlug,Paraoncidiumreevesii[J].TropicalJournalofPharmaceuticalResearch,2015,13(12):2071-2074.[7]ZhuHC,WeiLL,ShenHD,etal.CompletemitochondrialgenomeofParaoncidiumreevesii(Gastropoda,Pulmonata,Systellommatophora,Onchidiidae)[J].MitochondrialDNA,2012,23(5):379-381.[8]SunB,ChenC,ShenH,etal.SpeciesdiversityofOnchidiidae(Eupulmonata:Heterobranchia)onthemainlandofChinabasedonmoleculardata[J].MolluscanResearch,2014,34(1):62-70.[9]周娜,沈和定,陳誠.基于線粒體COⅠ基因的中國沿海和泰國普吉島里氏擬石磺群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].水產(chǎn)學報,2014,01:33-40.[10]TautzD．HypervariabilityofsimplesequencesasageneralsourceforpolymorphicDNAmarkers[J].NucleicAcidsResearch,1989,17(16):6463-6471．[11]孫效文,張曉鋒,趙瑩瑩,等.水產(chǎn)生物微衛(wèi)星標記技術研究進展及其應用[J].中國水產(chǎn)科學,2008,15(4):689-703.[12]TillierS.AnewmountainPlatevindexfromPhilippineislands(Pulmonata:Onchidiidae)[J].JournalofMolluscanStudies,1983,49(supp12A):198-202.[13]Klussmann-KolbA,DinapoliA,KuhnK,etal.Fromseatolandandbeyond–newinsightsintotheevolutionofeuthyneuranGastropoda(Mollusca)[J].BMCEvolutionaryBiology,2008,8(1):57.[14]李強,萬建民.SSRHunter,一個本地化的SSR位點搜索軟件的開發(fā)[J].遺傳,2005,05:808-810.[15]KalinowskiST,TaperML,MarshallTC.RevisinghowthecomputerprogramCERVUSaccommodatesgenotypingerrorincreasessuccessinpaternityassignment[J].Molecularecology,2007,16(5):1099-1106.[16]RoussetF.genepop’007:acompletere‐implementationofthegenepopsoftwareforWindowsandLinux[J].Molecularecologyresources,2008,8(1):103-106.[17]程小毛,黃曉霞.SSR標記開發(fā)及其在植物中的應用[J].中國農(nóng)學通報,2011,27(5):304-307.[18]LiuN,LiS,ZhangJ.Isolationandcharacterizationof16polymorphicmicrosatellitelociintheleopardcoralgrouperPlectropomusleopardus[J].ConservationGeneticsResources,2013,5(4):1067-1069.[19]汪桂玲,袁一鳴,李家樂.中國五大湖三角帆蚌群體遺傳多樣性及親緣關系的SSR分析[J].水產(chǎn)學報,2007,31(2):152-158[20]董秋芬,劉楚吾,郭昱嵩,等.9種石斑魚遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關系的微衛(wèi)星分析[J].遺傳,2007,29(7):837-843.DevelopmentofmicrosatellitemarkersforParaoncidiumreevesiibasedontranscriptomesequencingIlluminaHiseqTM2000WUXin,SHENHe-ding*,WANGDong-feng,LIUChen,YANGTie-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