基于IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的里氏擬石磺的微衛(wèi)星

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No.41276157），上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助。

吳欣（1990-）男，河南人，碩士研究生，主要從事海洋貝類分子標(biāo)記開發(fā)，E-mail:

wuxin2009001@163.com

沈和定，通訊作者，（1964-）男，上海人，教授，博士，主要從事海洋生物學(xué)研究，E-mail:

hdshen@基于IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的里氏擬石磺SSR標(biāo)記開發(fā)吳欣，沈和定*，王冬鳳，劉宸，楊鐵柱，刁亞（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室201306）摘要：使用IlluminaHiseqTM2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)里氏擬石磺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以所得的拼接序列為基礎(chǔ)，利用MISA和SSRHunter1.3軟件進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找，對(duì)選出的51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到單一清晰擴(kuò)增條帶的位點(diǎn)24個(gè)，對(duì)湛江里氏擬石磺群體擴(kuò)增結(jié)果表明，其中14個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)多態(tài)性。14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)得到的等位基因數(shù)在2-4之間，其中觀測(cè)雜合度（HoO）和期望雜合度（HeE）分別在0.0313-0.7143和0.0313-0.7084之間，多態(tài)性信息含量（PIC）在0.0895-0.6405之間，14個(gè)位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），另外2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25）。經(jīng)SequentialBonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，9個(gè)位點(diǎn)不偏離平衡（P>0.05）。開發(fā)的SSR標(biāo)記可用于里氏擬石磺群體遺傳學(xué)和石磺科貝類間的系統(tǒng)發(fā)生的研究，并為里氏擬石磺的群體種質(zhì)保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。關(guān)鍵詞：里氏擬石磺，轉(zhuǎn)錄組，微衛(wèi)星標(biāo)記石磺是軟體動(dòng)物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、石磺總科(Onchidioidea)、石磺科(Onchidiidae)的一群貝類，主要分布于熱帶或亞熱帶地區(qū)的海岸，灘涂、巖礁，紅樹林、潮間帶地區(qū)，是海洋與陸地的過渡帶生物[1-2]。我國(guó)的石磺主要分布在東南沿海的潮間帶高潮區(qū)，已報(bào)道易采集的主要有4種，包括瘤背石磺（Onchidiumstruma）、平疣桑葚石磺(Platevindexmortoni)、紫色疣石磺(Peroniaverruculata)、里氏擬石磺(Paraoncidiumreevesii)，學(xué)者對(duì)于石磺的研究主要集中在瘤背石磺，對(duì)后3種研究報(bào)道較少。其中，對(duì)于里氏擬石磺的研究主要集中在形態(tài)學(xué)[1-3]、化學(xué)成分測(cè)定[4-6]、線粒體基因組及群體多樣性的分析[7-9]幾個(gè)方面，未見利用分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性的報(bào)道。微衛(wèi)星，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)[10]，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點(diǎn)特異性、檢測(cè)方便和呈共顯性遺傳等特點(diǎn)，在水產(chǎn)動(dòng)物中主要用于遺傳連鎖圖譜的制備、性狀分析、QTL定位、群體遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳、種質(zhì)鑒定與親權(quán)分析、品種培育等方面[11]。里氏擬石磺作為海洋向陸地進(jìn)化的過渡物種之一，在研究海洋無脊椎動(dòng)物向陸地進(jìn)化延伸中具有重要作用[12-13]，本研究利用IlluminaHiseqTM2000高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)锸蠑M石磺進(jìn)行微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記開發(fā)，為研究其群體遺傳學(xué)和石磺科不同種貝類間的系統(tǒng)發(fā)生提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法：實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料于2015年5月采自廣東湛江海灘，共37個(gè)，樣本經(jīng)鑒定后均保存于95%無水乙醇并置于-20℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)方法1.2.1里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果隨機(jī)挑選6只于2012年10月采自湛江的里氏擬石磺個(gè)體進(jìn)行活體解剖，將解剖得到的不同組織保存于RNAlater（Qiagen:76104）中用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)并送晶能公司（GenergyBiotechnology）進(jìn)行IlluminaHiseqTM2000雙末端測(cè)序及生物信息學(xué)分析，共獲得原始數(shù)據(jù)9.161Gb，有效數(shù)據(jù)8.617Gb。通過denovo拼接獲得了長(zhǎng)度大于100bp的轉(zhuǎn)錄物233636條；UnigeneN50長(zhǎng)度485bp，經(jīng)GO注釋分析有124598(53.33%)條歸入生物學(xué)過程，51891(22.21%)條歸入分子功能，57136(24.46%)條歸入細(xì)胞組分，對(duì)大于200bp的拼接序列與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，22558條序列得到蛋白注釋，匹配蛋白數(shù)目為2910個(gè)，對(duì)注釋后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共涉及物質(zhì)及能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及免疫應(yīng)答等諸多生理生化過程。1.2.2微衛(wèi)星序列的來源根據(jù)晶能公司（GenergyBiotechnology）基于IlluminaHiseqTM2000測(cè)序平臺(tái)所得的拼接序列，經(jīng)MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)于非混合型位點(diǎn)篩選時(shí)，設(shè)置條件為單堿基重復(fù)至少10次，二堿基重復(fù)至少6次，3-6堿基重復(fù)至少5次，在此基礎(chǔ)上，如同一序列中兩個(gè)SSR位點(diǎn)間離小于50bp，則認(rèn)為這兩個(gè)SSR位點(diǎn)組成一個(gè)混合型SSR位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)引物前利用SSRHunter1.3[14]對(duì)經(jīng)MISA篩選過的含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列進(jìn)行再次篩選，保證序列的前后側(cè)翼有足夠的長(zhǎng)度用于設(shè)計(jì)引物，篩選條件和第一次一樣，最終篩選出51條含有微衛(wèi)星位點(diǎn)并適合設(shè)計(jì)引物的序列。1.2.3SSR引物設(shè)計(jì)與合成利用PrimerPremier5.0(/)軟件對(duì)上一步所得的51條拼接序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物長(zhǎng)度為19—26bp,GC含量在40%—60%之間，也可放寬至30%—70%，引物Tm值小于72°C，且上下游引物Tm值差別不能大于2℃，擴(kuò)增引物長(zhǎng)度在100—300bp，所設(shè)計(jì)引物在側(cè)翼保守序列內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)51對(duì)引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.4樣品DNA的提取取出之前保存于-20℃冰箱樣品，根據(jù)使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物基因組提取試劑盒（DP324）的要求，在每只樣品腹足處各取30mg組織塊對(duì)所需樣品的用于DNA進(jìn)行提取，提取后的DNA置于-20℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?.2.5PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為10μL，包括上下游引物各0.3μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O4μL，DNA模板0.4μL。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5分鐘；94°C30s，退火30s，72°C30s，共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。產(chǎn)物保存于4°C。引物初篩PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Godview染色，電泳條件為：115V，35min，電泳緩沖液為1×TAE，凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物進(jìn)行群體檢測(cè)時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳條件為：電壓110V，電泳時(shí)間6h，電泳緩沖液為1×TBE；電泳結(jié)束后用硝酸銀對(duì)凝膠染色并使用相機(jī)進(jìn)行拍照。1.2.6里氏擬石磺SSR引物的篩選及群體檢測(cè)隨機(jī)選取5個(gè)里氏擬石磺個(gè)體，提取其DNA并將其混合作為引物特異性和最適退火溫度篩選時(shí)的模板DNA，根據(jù)每對(duì)引物的Tm值設(shè)置間隔為1.5°C的溫度梯度，共設(shè)置8個(gè)溫度梯度，用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增清晰，條帶單一的引物留用，確定每對(duì)引物的最適退火溫度，以便進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。選取32個(gè)湛江群體的里氏擬石磺個(gè)體，提取DNA，并作為模板，使用初篩后留用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測(cè)方法遵照上述方法，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行拍照留存。1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析對(duì)湛江群體里氏擬石磺的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，將每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增條帶按從小到大的順序標(biāo)記為A，B，C…，并統(tǒng)計(jì)出每個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)行群體檢測(cè)時(shí)的基因型，根據(jù)結(jié)果，使用Cervus3.0[15]軟件計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（numberofallele,Na），觀測(cè)雜合度（observedheterozygosity,HoO），期望雜合度（expectedheterozygosity,HeE），多態(tài)性信息含量（polymorphicinformationcontent,PIC），使用Genepop4.2[16]進(jìn)行每個(gè)位點(diǎn)的Hardy–Weinberg平衡的檢測(cè)。2結(jié)果分析2.1轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的軟件分析結(jié)果利用MISA軟件在里氏擬石磺轉(zhuǎn)錄組中查找SSR位點(diǎn)的結(jié)果，如表1所示。表1SSR分析結(jié)果table1OutputstatisticsofSSRSSR標(biāo)記重復(fù)類型拼接序列個(gè)數(shù)RepeatmotifofSSRsNumbersofcontig查找到的SSR總個(gè)數(shù)67696TotalnumberofidentifiedSSRs含有SSR位點(diǎn)序列個(gè)數(shù)46164ThenumberofsequencescontainingSSRs含有多于1個(gè)SSR位點(diǎn)的序列數(shù)14423Numberofsequencescontainingmorethan1SSR單堿基型SSR個(gè)數(shù)53948Thenumberofmono-nucleotideSSR雙堿基型SSR個(gè)數(shù)7577Thenumberofdi-nucleotidesSSRs3堿基型SSR個(gè)數(shù)4579Thenumberoftri-nucleotidesSSRs4堿基型SSR個(gè)數(shù)1572Thenumberoftetra-nucleotidesSSRs5堿基型SSR個(gè)數(shù)14Thenumberofpenta-nucleotidesSSRs6堿基型SSR個(gè)數(shù)6Thenumberofhexa-nucleotidesSSRs2.2里氏擬石磺SSR篩選結(jié)果51對(duì)引物在經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳的初篩之后有24對(duì)擴(kuò)增出清晰單一的條帶，擴(kuò)增率為47％。將這些擴(kuò)增出清晰單一條帶的24對(duì)引物在采自湛江群體的36個(gè)里氏擬石磺個(gè)體做進(jìn)一步篩選，有14個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為多態(tài)性，其余位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)性。在表現(xiàn)出多態(tài)性的14個(gè)位點(diǎn)中，7個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?，4個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?，3個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為2等位基因。14個(gè)位點(diǎn)中，1個(gè)位點(diǎn)為五堿基重復(fù)，2個(gè)位點(diǎn)為四堿基重復(fù)，11個(gè)位點(diǎn)為三堿基重復(fù)，且四，五堿基重復(fù)的次數(shù)均為5，三堿基的重復(fù)次數(shù)均為6。14對(duì)引物中最低退火溫度為50.5°C最高退火溫度為61°C，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度在90—370bp之間。2.3里氏擬石磺湛江群體遺傳多樣性分析對(duì)14對(duì)SSR引物在取自湛江群體的32個(gè)體擴(kuò)增片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，14個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)在2—4之間，其中觀測(cè)雜合度（HoO）和期望雜合度（HeE）分別在0.0313-0.7143和0.0313-0.7084之間，多態(tài)性信息含量（PIC）在0.0895-0.6405之間，其中2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25）。經(jīng)SequentialBonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，9個(gè)位點(diǎn)不偏離平衡（P>0.05），其余位點(diǎn)均顯著偏離平衡（0.05>P）（表2）。3討論和結(jié)論SSR是一種應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)里氏擬石磺進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)不僅比傳統(tǒng)方法更為快捷，花費(fèi)更少，而且在獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的同時(shí)可以查找對(duì)應(yīng)EST序列的功能性狀，與基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。相比于基因組SSR，基于轉(zhuǎn)錄組EST序列開發(fā)的SSR多態(tài)性較低[17]，本實(shí)驗(yàn)共獲得14個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC>0.5），10個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.5>PIC>0.25），2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)性（PIC<0.25），這表明湛江里氏擬石磺野生群體的遺傳多態(tài)性處于中度多態(tài)性水平。14個(gè)位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)偏離平衡（P<0.05），可能的原因是種群中有個(gè)體產(chǎn)生基因漂變，或者出現(xiàn)了無效等位基因[18]。作為海洋無脊椎動(dòng)物向陸地延伸的過渡物種，石磺科貝類認(rèn)為是研究海洋貝類向陸地輻射生活的最好代表。而利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記作為研究水產(chǎn)動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化已經(jīng)得到廣泛引用，汪桂玲[19]等曾利用微衛(wèi)星分析五大湖野生三角帆蚌群體的遺傳多樣性和種間發(fā)生關(guān)系；董秋芬[20]等利用13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)9種石斑魚的種系發(fā)生關(guān)系進(jìn)行研究；這些都為利用SSR標(biāo)記研究石磺科貝類間種系發(fā)生提供了借鑒。本研究中利用高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)的14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，不僅為研究里氏擬石磺的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也可用于石磺科貝類間種系發(fā)生關(guān)系的研究中。表214對(duì)SSR引物在32個(gè)里氏擬石磺擴(kuò)增特性的描述Table2Primersequencesandcharacterizationof14polymorphicmicrosatellitelociin32ParaoncidiumreevesiiLocusPrimers:（5’→3’）RepeatmotifTa(°C)Sizerange(bp)NaHoOHeEPICPvalueHWEPR4F:CTTGTTACACCCCGCTCCC(GCCCT)56090-10040.71430.70840.64050.0349R:CTGTGACATAATCAATGCTGCTCTPR5F:TGATGCGTCAATACAAGGGTG(ATGC)550.5172-18530.37500.32290.28881.0000R:AGTTCGGAGTGCGGAATGGTPR6F:AGTTACAGGTCCAGACAATG(AATA)556.3250-27520.69440.50350.37330.0408R:CTAAGACGGCAATCCAATACPR9F:TAAAGAAGACAGAAACAGGCAACA(ATC)661128-16140.40630.35660.33331.0000R:CAACGGTCATAAAGACTAAAGGAATPR10F:TCTGCTGAACTTGCCATTGT(ATT)657131-15040.39290.34680.32271.0000R:TCCTCTACCAGGGCTCAAAGPR12F:TCCACCTTCTTTATTACCACCC(TAT)656122-13620.03130.03130.03031.0000R:GCCACGCAGTATTGATTGTTPR14F:TTCTTCTTCAGGGAGGTAAA(CAT)655161-19330.44440.55240.44080.1739R:TCAAGTTCTTCATTCGGTTCPR18F:TGTTGGTTGCCTGCCTTTCA(GTA)656150-16220.32140.49290.36690.1125R:ATCGGCTGGCTTGCCTGTTCPR20F:CTGTCTGTTTGGCTGTGATG(TTG)653185-28040.43750.41720.38010.0555R:AATGAAGTCTTGGGTAGATGAAPR22F:GACAAACGACGAGCGACAAA(TGC)652120-19530.45830.54960.48020.3018R:TGGAAGAAGGACAAGGAGGAGTAPR28F:GGTCCCTCTGTGGATTTGGT(GAT)656195-27040.61290.61710.53150.0459R:AAGGATTCTGGCTTCGGTGAPR37F:CATTCGCCCTCTGTTCTATCC(ATC)661260-37030.43330.36550.32621.0000R:TGTCAAACGGTGCTTCTCCTAPR46F:ATAATGATGCTGGAACTGAT(ATT)652250-30040.62500.46730.37990.0304R:AGGATAACAAACTGGGACTTPR50F:TCGGGTTTCCTTGTCTTGTA(ATT)658102-17540.06250.09230.08950.0469R:ATCTCCATCACCTTGGCAGTLocus：位點(diǎn)；Ta：退火溫度，Annealingtemperature；Na：等位基因數(shù)numbersofalleles；HOHo：觀測(cè)雜合度observedheterozygosity；HEHe：期望雜合度expectedheterozygosity；PIC：多態(tài)性信息含量polymorphicinformationcontent；Pvalue：P值thetestfordeviationfromHWE參考文獻(xiàn)（References）：[1]吳旭峰,沈和定,吳文健,等.我國(guó)華東沿海4種石磺形態(tài)學(xué)比較[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2010,06:92-100.[2]BouchetP,RocroiJ.Classificationandnomenclatorofgastropodfamilies[M].47ed.InstituteofMalacology,2005.[3]王冬鳳,沈和定,吳欣.石磺科3種貝類皮膚顯微結(jié)構(gòu)比較[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2015,50(3):437-444.[4]黃金田,王愛民.瘤背石磺營(yíng)養(yǎng)成分分析及品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].海洋科學(xué),2008,32(11):29-35.[5]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.四種石磺科貝類的膽甾醇含量測(cè)定[J].海洋科學(xué),2015,39(1):24-28.[6]SunB,ShenH,WuH,etal.DeterminationofChemicalConstituentsoftheMarinePulmonateSlug,Paraoncidiumreevesii[J].TropicalJournalofPharmaceuticalResearch,2015,13(12):2071-2074.[7]ZhuHC,WeiLL,ShenHD,etal.CompletemitochondrialgenomeofParaoncidiumreevesii(Gastropoda,Pulmonata,Systellom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