動植物細胞培養(yǎng)

動植物細胞培養(yǎng)動植物細胞培養(yǎng)與產(chǎn)品動植物細胞培養(yǎng)是指動植物細胞在體外條件下的存活或生長,此時細胞不再形成組織。其產(chǎn)品包括疫苗單克隆抗體免疫調(diào)節(jié)劑酶激素

動、植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別動物細胞無細胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細胞附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需有血清。動物細胞對環(huán)境敏感，包括pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力都比微生物有更嚴的要求，一般須嚴格的監(jiān)測和控制。植物細胞對營養(yǎng)要求較動物細胞簡單。但由于植物細胞培養(yǎng)一般要求在高密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細胞生長較微生物要緩慢，長時間的培養(yǎng)對無菌要求及反應(yīng)器的設(shè)計也提出特殊的要求。動植物、微生物細胞的培養(yǎng)比較微生物動物細胞植物細胞

大小懸浮生長營養(yǎng)要求生長速率代謝調(diào)節(jié)環(huán)境敏感細胞分化剪切應(yīng)力敏感傳統(tǒng)變異，篩選技術(shù)細胞或產(chǎn)物濃度1-10μm

可以簡單快，倍增時間0.5-5小時內(nèi)部不敏感無低廣泛使用較高10-100μm

多數(shù)細胞需附著表面才能生長非常復(fù)雜慢，倍增時間15-100小時內(nèi)部、激素非常敏感有非常高不常使用低10-100μm

可以，但易結(jié)團，無單個細胞較復(fù)雜慢，倍增時間24-74小時內(nèi)部、激素能忍受廣泛范圍有高有時使用低第一節(jié)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)動物細胞體外培養(yǎng)的歷史可追溯到1907年，美國生物學(xué)家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。在隨后的近一個世紀里，隨著細胞生物學(xué)、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法等領(lǐng)城的不斷豐富和完善，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進程中顯示出強大的潛力。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展一、培養(yǎng)基工業(yè)用動物細胞培養(yǎng)基與實驗室培養(yǎng)基基本一致，實驗室用培養(yǎng)基需添加5％一10％小牛血清，但大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞應(yīng)用小牛血清，無論從經(jīng)濟上還是實際可能性來講，都是不現(xiàn)實的，且血清產(chǎn)地、批號及動物個體不同，質(zhì)量差異甚大，給大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)及產(chǎn)品分離純化帶來許多困難。目前正大力開展無血清培養(yǎng)基研究。①基本合成培養(yǎng)基；②基本合成培養(yǎng)基加生長因子；③基本合成培養(yǎng)基加組織抽提物。

已有商品市售無血清培養(yǎng)基主要有下述3類：第二類亦稱為添加生長因子培養(yǎng)基，其特點是組成物質(zhì)的種類與數(shù)量均為已知，并可按需要增減與刪除，其最大優(yōu)點是：①可用于培養(yǎng)不同種類的細胞及含血清培養(yǎng)基中不能生長的細胞；②可用于雜種細胞、基因工程細胞及突變體細胞培養(yǎng)，生產(chǎn)有用物質(zhì)。大大簡化細胞培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化操作。

目前人們正研究起血清作用的各類激素及生長因子，如鐵傳遞蛋白、乙醇胺、胰島素、促胃酸激素、維生素C、考的松及硒等成分的功能。以期獲得更適宜于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基。

二、培養(yǎng)技術(shù)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與實驗室培養(yǎng)相比，培養(yǎng)條件更嚴格，控制難度更大，其培養(yǎng)方法可概括為：懸浮培養(yǎng)固定化培養(yǎng)微載體（Microcarrier）培養(yǎng)法

1，細胞懸浮培養(yǎng)法動物細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長繁殖的培養(yǎng)方法謂之懸浮培養(yǎng)法。其培養(yǎng)方式有批量法半連續(xù)法連續(xù)法適用于培養(yǎng)確立細胞株、雜交瘤細胞、腫瘤細胞、血液細胞及淋巴組織細胞，用于大量生產(chǎn)疫苗、α-干擾素、白介素等藥品。此法不適于包括二倍體細胞在內(nèi)的正常組織細胞的培養(yǎng)。細胞懸浮培養(yǎng)法的優(yōu)點可連續(xù)收集部分細胞進行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害。細胞收率高，并可連續(xù)測定細胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應(yīng)器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5％CO2的無菌空氣，保持細胞懸浮態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧。此外不同細胞懸浮條件亦異，為使細胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液時尚可不必連續(xù)通入含5％CO2空氣。

懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器籠式通氣攪拌罐中空纖維管陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器2，固定化培養(yǎng)法動物細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)謂之細胞固定化培養(yǎng)法。動物細胞幾乎都可采用固定化方法培養(yǎng)。固定化方法有：吸附法（所用載體有陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒）包埋法（將細胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中）固定化培養(yǎng)優(yōu)點細胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長；細胞損傷程度低；易于更換培養(yǎng)液；細胞和培養(yǎng)液易于分離；培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡化了產(chǎn)品分離純化操作。固定化培養(yǎng)裝置多層平板裝置螺旋卷膜培養(yǎng)器多層托盤式培養(yǎng)器卷帶式培養(yǎng)器中空纖維及流化床式培養(yǎng)器中空纖維培養(yǎng)器優(yōu)點細胞生長密度高，可達l08個／毫升以上，細胞處于接近生理狀態(tài)的理化梯度中；營養(yǎng)物質(zhì)可有效分布，代謝廢物可及時排除；細胞培養(yǎng)可達數(shù)月，易于實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)；細胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高。產(chǎn)品純度可高達60％-90％；利于降低成本；反應(yīng)器體積小并可用于培養(yǎng)多種細胞。

3，微載體培養(yǎng)方法將動物細胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。制備微載體的材料主要有：葡聚糖（DEAE—SephadexA50及A25）塑料明膠玻璃纖維素微載體培養(yǎng)優(yōu)點兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，且是均相培養(yǎng)。細胞所處環(huán)境均一，放大容易。培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，障低了污染發(fā)生的機會。三、培養(yǎng)條件控制動物細胞生長緩慢，又具有錨地依賴性，培養(yǎng)時為防止污染，除反應(yīng)器密封性能良好外，尚需添加抗生素，培養(yǎng)過程還要求培養(yǎng)器、管道及接頭處所用材質(zhì)不可釋放出對細胞有毒害的物質(zhì)。在分批培養(yǎng)時，隨著細胞生長，營養(yǎng)消耗，必然產(chǎn)生乳酸等代謝物的積累，引