斑馬魚卵抑素對骨骼肌增殖的調控作用

斑馬魚卵抑素對骨骼肌增殖的調控作用

根據以往的研究，racemy是一個激生長因子超基因家族的成員。正如其他遺傳因素超基因家族的成員一樣，rax7信號分子的調節(jié)可以抑制肌肉衛(wèi)星細胞的生長和成年階段的肌肉組織的生長。正如其他遺傳因素超基因家族的成員一樣，racemat活性物質的第一合成出現在信號遺傳、前體功能物質和c-c活動物質的形式中。前體分子通過兩次蛋白質水處理工藝形成具有生物活性的抗凝劑分子。在水解活動開始之前，抗凝劑前體可以以非公共或私人價格組合形成二聚體，前體分子也可以通過親水糖合物二聚體形成非活性二聚體，以抑制抗健素和受體的結合。根據研究，danioremote的抗腫脹性肌腱與其他高等動物相似，但也會抑制肌肉骨骼的生長。卵泡抑素(follistatin,Fst)是一種分泌性的糖蛋白具有和激活素受體ⅡB亞基(activinreceptorⅡBActRⅡB)強烈的親和作用.Fst也具有與部分轉化生長因子成員直接結合的能力,被認為是一些轉化生長因子超基因家族成員信號分子的有效阻抑蛋白分子.一般認為,其直接與多數轉化生長因子超基因家族成員信號分子結合的能力較弱于其與激活素(activin)的結合力[6~8].據報道,Fst可以通過競爭結合而阻抑生長分化因子-11(growthdifferentiationfactor-11,GDF-11)和抑肌素的活性.其基因敲除后的新生突變小鼠顯示出肌肉量顯著下降的表型,而在肌肉組織中高表達Fst的小鼠與野生型小鼠相比,出現因肌肉細胞增殖和細胞個體增大所導致的骨骼肌總量明顯增長.最近研究發(fā)現,鯉科魚類斑馬魚中存在著兩種Fst基因,Fst1和Fst2.其中,Fst1是一種存在于所有硬骨魚類的Fst種類,同源性分析表明它與其他高等脊椎動物的Fst更為相似.在斑馬魚的早期胚胎發(fā)育階段,Fst1最早的表達出現在新生的體節(jié)外緣層細胞中,Fst1強烈表達于體節(jié)腹面和側面區(qū)域,而該區(qū)域是魚類骨骼肌和鰭條肌主要肌肉前體細胞集中區(qū)域,暗示Fst1與鯉科魚類的肌肉生成發(fā)育過程相關.考慮到在小鼠肌肉組織中高表達Fst蛋白可以有效地阻止生長分化因子(包括抑肌素),利用斑馬魚骨骼肌特異的肌球蛋白輕鏈(myosin,lightpolypeptide2,skeletalmuscle,mylz2)基因的啟動子構建了肌肉特異性高表達Fst1的斑馬魚轉基因載體質粒,并通過顯微注射及轉基因篩選,獲得了在肌肉組織中穩(wěn)定高表達Fst1的斑馬魚穩(wěn)定遺傳轉基因品系.該轉基因品系的魚體體重僅發(fā)生小量增加,但本研究發(fā)現,通過在肌肉組織中特異性高表達Fst1可以導致成年斑馬魚肌肉組織中重要成肌因子myoD和pax7基因的增強表達.而且通過組織切片觀察發(fā)現,肌纖維數量的顯著增加可導致該轉基因品系肌肉組織增生.本研究提示,鯉科魚類組織中的Fst具有與哺乳動物類似的對抑肌素的負調控作用.1材料和方法1.1斑馬魚fst1的結構表達斑馬魚mylz2:EGFP轉基因載體由新加坡國立大學宮知遠博士提供.Tol2增強子誘捕質粒由新加坡國立分子與細胞研究所VladimirKorzh博士提供.正向引物(5′-GGATCCACCATGTACCCATACGAT-GTTCCAGATTACGCT-3′)和反向引物(5′-GGATCC-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′),均含BamHⅠ識別位點,采用PCR擴增從pCMV-HA質粒(Clontech,PT3285,829~1049bp)獲得一個含有多克隆位點(multiplecloningsites,MCS)和SV40轉錄結束的多腺苷酸尾序列.擴增片段經BamHⅠ酶切后,克隆進mylz2:EGFP載體,從而獲得肌肉特異性表達的中間載體.隨后,通過XbaⅠ酶切與Klenow酶的堿基補平和自連反應,將該中間載體的XbaⅠ位點破壞.利用已在引物設計中加入了XbaⅠ酶切位點的正向引物(5′-AATTCGCCACAGAGGAATG-3′)和反向引物(5′-TTTATTGCAGCTTATAATGGTT-3′)將含有mylz2啟動子、MCS和SVSV40轉錄結束的多腺苷酸尾序列的DNA片段由該中間載體中擴增出來.通過XbaⅠ酶切,克隆進Tol2增強子誘捕質粒后,獲得擁有肌肉特異性表達的mylz啟動子、供目的基因插入的多基因克隆位點,以及一個由斑馬魚皮膚角質蛋白8(keratin8)啟動子基本元件調控的熒光蛋白EGFP表達的轉基因載體.以基因庫中存在的斑馬魚卵泡抑素1(Fst1)的基因序列(登錄號:NM_131037)為依據,設計一對含有EcoRⅠ識別位點的正向引物(5′-AT-GAATTCGGATGCTAAGGATGCTAAAGCG-3′)和含有XhoⅠ識別位點的反向引物(5′-ATCTCGAGCTAC-TTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGCGCACACAG-CTTCCTCCG-3′).通過RT-PCR技術從斑馬魚胚胎期的總RNA提取物中擴增出斑馬魚卵泡抑素(Fst1)的全長0.9kb片段,并通過EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切方式將該擴增出的斑馬魚Fst1全長片段克隆入前述的肌肉組織特異性高表達的轉基因載體中.斑馬魚Fst1表達將由斑馬魚肌肉組織特異、高效表達mylz2的啟動子調控.同一載體中由斑馬魚keratine8啟動子調控的在斑馬魚表皮細胞中表達熒光蛋白的單元將可作為轉基因的篩選標記(圖1(A)).位于這些功能性表達調控單元兩側的Tol2轉座子臂將提高功能性表達調控單元整合到斑馬魚基因組的效率.1.2斑馬魚fst1的表達及純化青鳉(Oryziaslatipes)的轉座酶編碼DNA克隆由V.Korzh博士提供.10ng的Fst1轉基因質粒DNA和25ng的體外合成轉座酶mRNA顯微注射入1~2細胞期的斑馬魚魚卵,具體過程按照Parinov等人所描述方法.使用Leica熒光體視顯微鏡對注射后魚卵中熒光蛋白的表達情況進行觀察.通過對斑馬魚表皮細胞中表達熒光蛋白的情況,對穩(wěn)定發(fā)生轉基因的品系進行初篩,為獲得具有穩(wěn)定遺傳特征的轉基因F1代魚,對每尾在皮膚中表達有熒光的F0代與野生型親本交配,觀察其子代各100粒受精卵.對F1中皮膚表達熒光的魚做進一步Fst1原位雜交實驗,證實Fst1基因在肌肉組織中高量表達,從而獲得轉基因魚的穩(wěn)定遺傳品系,并反溯出其轉基因品系的原始F0代魚.同時采用針對基因組DNA的PCR方法檢查轉基因片段的整合.以斑馬魚與基因組DNA為模板,通過正向引物(位于mylz2啟動子區(qū)域)5′-TCAGTGGCTACAGCTCATTCA-3′和反向引物(位于斑馬魚Fst1編碼區(qū)域)5′-TTTGTCTG-GTCCACCACGCAA-3′進行PCR擴增,預期的整合片段長度為981bp.這些穩(wěn)定遺傳的F0代魚與野生型的交配后代中Fst1高表達陽性魚(轉基因遺傳雜合子)作為后續(xù)研究材料.1.3na多聚酶抑制劑fst1的合成采用由地高辛標記(digoxigenin,DIG)的RNA探針開展原位雜交分析,其詳細操作步驟按Li等人所述.將斑馬魚Fst1cDNA序列克隆至pBluescript載體,經過BamHⅠ酶切線性化后,由T7RNA多聚酶合成Fst1反義RNA探針.以經過4%多聚甲醛溶液固定的各發(fā)育時期至5dpf(daypostfertilization)發(fā)育階段的幼苗作為原位雜交材料.雜交緩沖液成分:50%甲酰胺,5倍SSC緩沖液(1倍緩沖液成分為15mmol/LNaCl和15mmol/L檸檬酸鈉,pH7.6),50mg/mL肝素,50mg/mLtRNA和0.1%吐溫),70℃雜交,后與堿性磷酸酶標記的抗DIG抗體孵育,加入硝基四氮唑(nitrobluephosphate,NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo,4-chloro,3-indolilphosphate,BCIP)顯色.1.4斑馬魚fst1,fst1的熒光定量pcrfst1,fst1的合成采用實時PCR對處在60dpf階段的非轉基因對照魚和高表達Fst1轉基因魚肌肉組織中的Fst1、成肌因子myoD,pax7的表達水平進行檢測.具體操作按照產品說明書進行.使用Trizol溶液(Invitrogen)從約100mg的斑馬魚肌肉組織中提取總RNA.隨后,采用不含RNA酶的DNA水解酶去除提取的總RNA樣品中可能混雜的DNA.單鏈cDNA由SuperScript?Ⅲplatinum?One-stepqRT-PCR試劑盒(Invitrogen)中的反轉錄酶合成.隨后,將利用設計的特異性正向、反向引物對Fst1,myoD和pax7進行擴增(引物序列見表1),以斑馬魚持家基因β-肌動蛋白(actin)作為內參,對所擴增出的斑馬魚片段進行定量分析,并對所有擴增片段進行測序鑒定.使用SequenceDetector(PRISM7700;ABI,FosterCity,CA,USA)開展熒光實時PCR檢測.每個反應體積為2μLcDNA和終濃度為2ng/μL的引物,樣品最初加熱至50℃保溫2min,然后95℃保溫10min,PCR反應:95℃保溫15s,60℃保溫1min,共40個循環(huán).采用SDSv1.7a分析軟件確定每個樣品中的檢測閾值和最小檢測循環(huán)次數.1.5橫截肌肉組織石蠟包埋、切片在30和60dpf階段,對轉基因和非轉基因對照魚稱重.對于肌肉組織學分析,分別采取10尾非轉基因和穩(wěn)定遺傳的轉基因F1的60dpf階段的魚體橫截肌肉組織,用Bouin’s溶液固定10h,再按照常規(guī)石蠟包埋、切片程序,經常規(guī)的伊紅/美藍(Haematoxilin/Eosin)染色,測算背鰭前端斷面組織切片指定區(qū)域中的肌纖維數.2結果2.1宏觀表達特征檢測將經BglⅡ酶切線性化的轉基因質粒與轉座酶共注射入1~2細胞期的斑馬魚受精卵后,75%注射后受精卵在孵化期內顯示出異常的發(fā)育缺陷,并導致胚胎死亡.這可能是由于在胚胎發(fā)育階段Fst1的錯誤表達所致.典型的Fst1注射后F0代受精卵的表型特征如圖1(C)所示,以a,b,c標記胚胎.180粒注射后的受精卵中仍有約45尾魚存活至成年期(圖1(D)和(E)).由于轉基因載體的構架中含有表皮表達熒光蛋白的調控原件,因此可以通過對注射后的魚卵以及F1代魚苗的表皮細胞中表達熒光蛋白特性進行觀察(圖1(B)和(E)),從而便于對肌肉組織中高表達Fst1的穩(wěn)定轉基因魚品系的篩選.共觀察到28尾F0代斑馬魚具有表皮熒光表達特征,其中有3尾被證實為有表皮細胞熒光蛋白表達的F1代轉基因魚.通過對F1代基因組DNA的PCR檢測,也證實有轉基因片段的插入(圖1(G)).這些穩(wěn)定遺傳的魚作為F0代與野生型交配,產生F1代轉基因魚用以研究,F0~F1的陽性遺傳率介于3%~7%(圖1(F)).不同于最初構建Fst1高表達轉基因F0代顯微注射的情況,肌肉組織中高表達Fst1的F1代轉基因魚與非轉基因同胞個體一樣,均未觀察到其胚胎期發(fā)育的顯著異常(圖1(E)和(F)).隨后通過實時PCR反應,證實了在60dpf階段3株獨立遺傳轉基因品系的肌肉組織中都對應于其對照轉基因陰性同胞個體具有較高的Fst1表達,其中轉基因品系2或3具有相當于其非轉基因個體6倍的表達水平(圖1(H)).2.2fpsd的比較對魚齡為30和60dpf,分別來自同一父母本的轉基因魚和非轉基因對照魚進行體重稱量.在日齡30天時,轉基因魚與非轉基因對照魚在體重上并未表現出顯著差異.然而,在日齡達到60天時,Fst1的F1代雜合子魚體較其非轉基因姊妹有8.14%的平均體重增加(表1).與抑肌素相關基因的研究相比,前人報道的在肌肉中高表達抑肌素前體突變蛋白的斑馬魚純合子相對于其非轉基因姊妹體重增加(10%~15%),但其雜合子轉基因斑馬魚卻未表現出任何體重的增加.雖然未進行針對Fst1轉基因純合子斑馬魚的觀察,但本實驗中Fst1的F1代雜合子已經表現出體重的增加,說明肌肉中高效表達Fst1具有比抑肌素前體突變蛋白更強的促進肌肉生長的作用.2.3fst1/pax7對fst1基因突變斑馬魚肌肉組織的影響為觀察肌肉組織中高表達Fst1對重要的肌肉生長調控基因的影響,采用整體原位雜交技術對胚胎期的轉基因魚進行了myoD基因表達觀察.結果未發(fā)現Fst1轉基因魚在胚胎期的myoD表達與非轉基因魚有顯著不同(數據未顯示).但采用實時PCR分析技術對日齡60天的轉基因和非轉基因魚的肌肉組織中myoD的表達量進行觀察,卻發(fā)現在成年的Fst1轉基因魚肌肉組織中myoD的表達量較非轉基因姊妹魚有顯著增高(圖2).與myoD類似,成肌因子pax7在肌肉衛(wèi)星細胞的活化、增殖和分化中起關鍵的促進作用.通過對Fst1轉基因斑馬魚肌肉組織中表達的pax7檢測,發(fā)現60dpf轉基因斑馬魚中的pax7表達水平較非轉基因同胞有明顯的增高(圖2).以上結果表明,肌肉組織中高表達Fst1可以促進肌肉生長活動.2.4fst1轉魚的肌纖維計數和含量為了觀察Fst1轉基因高表達是否會影響斑馬魚肌肉生長,取60日齡的轉基因和非轉基因姊妹群的典型樣本對其對等區(qū)域的肌肉組織進行組織學觀察,以測定肌纖維數量和肌纖維橫截面面積(圖3).測定了在相同放大倍數下轉基因魚和非轉基因姊妹成魚位于背鰭第一鰭條基部的截面相應區(qū)域的肌纖維數量(圖3(C)~(G)),記錄到在Fst1轉基因魚肌肉組織的相應區(qū)域平均具有更多的肌纖維數(轉基因組:604.14±47.76,n=10;非轉基因組:462.63±32.12,n=10).觀察到,Fst1轉基因魚肌肉組織相同區(qū)域中存在著更多的肌纖維,因而其相應的肌纖維平均具有的截面也較非轉基因姊妹魚小(圖3(D)~(G)),表明未發(fā)生肌纖維細胞的體積增大.以上結果表明,Fst1的高表達主要以肌纖維增殖(hyperplasia)而非肌纖維增大(hypertrophy)的方式促進肌肉的生長.3結構方程模型中基因td1的表達對肌肉組織生長和肌肉組織體重的影響本研究采用斑馬魚肌肉特異性高表達mylz2啟動子對Fst1在肌肉組織中的增強表達,來觀察高表達Fst1對魚類肌肉生長可能具有的調控作用.起初的轉基因載體注射使大量受精卵(75%)發(fā)生明顯的發(fā)育缺陷,可能是由于Fst1對斑馬魚原腸期發(fā)育階段的背腹軸決定過程中所起的關鍵作用所致.但尚有少數(25%)注射魚受精卵得以存活并在其基因組中成功攜帶了mylz:Fst1的表達調控單元.這部分受精卵的存活可能得益于mylz啟動子的肌肉表達特異性以及其在胚胎階段表達較晚的特性.本結果表明,在肌肉組織中高效表達Fst1可以顯著地增強重要的成肌因子myoD和pax7在肌肉中的表達(圖2),促進肌纖維細胞的增殖,并以此方式促進斑馬魚的肌肉生長(圖3).抑肌素是轉化生長因子超基因家族中的主要肌肉生長調控因子.在哺乳動物中,缺少抑肌素基因的純合子突變體表現為肌肉總量的顯著增加.先前的研究也表明,通過RNA干擾和morpholino注射技術等對胚胎期的斑馬魚抑肌素功能的抑制可以導致斑馬魚在胚胎發(fā)育期的重要成肌基因的高表達并出現魚體的大型化.可是,本研究與前期在斑馬魚中開展的另一項有關抑肌素前體突變蛋白肌肉高效表達轉基因工作相似,均未能在斑馬魚胚胎期至2周齡前的斑馬魚早期發(fā)育過程中觀察到成肌因子myoD和myf5的增高表達(數據未顯示),也未觀察到在斑馬魚早期發(fā)育過程中促進肌肉增長的表型(表2).但本研究中的mylz2:Fst1轉基因斑馬魚,與過去高表達Fst1轉基因小鼠出現的表型相似.成年階段的轉基因斑馬魚與非轉基因對照魚相比顯示出肌肉生長增強的特征,表明在魚類肌肉組織中轉基因高表達Fst1具有對肌肉組織生長的促進作用.在魚體重量性狀方面,獲得的mylz2:Fst1轉基因魚,也與前人通過顯微注射抑肌素干擾性RNA導致斑馬魚在幼苗期的大型化現象的觀察不同.本實驗觀察到雜合子Fst1轉基因魚在早期階段,其體重與非轉基因魚并未顯示出明顯差異,而僅在成魚階段的轉基因魚體重有小量增加(表2).本實驗采用的是在肌肉組織中高表達Fst1,其效應可能僅集中于肌肉組織中抑肌素功能的抑制,而抑肌素RNA注射方式則實際是對全身性抑肌素作用的抑制.本實驗中,由于僅在肌肉組織中高表達Fst1,所以僅在轉基因魚肌肉組織中提供了對抑肌素活性的阻抑作用,而未影響抑肌素在魚體其他組織中的潛在作用.從而使得本實驗的轉基因魚未在幼年期就發(fā)生明顯的體重增加,而是僅在成年期轉基因斑馬魚肌肉組織發(fā)生增生,其表型較早期全身性抑肌素RNA干擾方式所產生的體重增加的表型相對溫和.此外,也可能因為在本實驗中,Fst1的表達由于受mylz2啟動子調控,其表達起始于20hpf,而不同于顯微注射方式,在胚胎發(fā)育的更早期就可能顯現出抑制效果.Lee和McPherron,Zhu等人通過對小鼠肌肉組織中高表達抑肌素相關蛋白的觀察,發(fā)現在肌肉組織中高表達Fst相對于高表達抑肌素前體突變蛋白,Fst基因的高表達具有更強的對肌肉組織生長的促進作用.值得注意的是,對高表達Fst1轉基因斑馬魚成年階段肌肉組織的成肌基因的表達、肌肉組織的增生以及體重的增加等特性的分析,與在斑馬魚肌肉組織中高表達抑肌素前體突變蛋白的觀察結論對比,也得出相同的結論.其原因可能是在肌肉組織中高表達抑肌素前體突變蛋白將僅能抑制體內野生型抑肌素分子對肌肉生長的負調控作用,而認為Fst1除了可以抑制抑肌素的功能外,還可能對其他轉化生長因子超基因家族成員(如生長分化因子-11等)潛在的對肌肉組織生長的抑制作用發(fā)生阻抑效果從而使其在肌肉組織中高表達Fst1,具有比抑肌素前體突變蛋白高表達更明顯的效果.本研究發(fā)現,在成年mylz2:Fst1轉基因斑馬魚肌肉組織中可以觀察到成肌因子myoD的增強表達,而該現象并未在抑肌素前體突變蛋白高表達的轉基因斑馬魚中被觀察到同時,與在肌肉組織中高表達抑肌素前體突變蛋白的轉基因斑馬魚相比,在肌肉組織中高表達Fst1對肌纖維的增殖更為明顯.這些都可能反映出Fst1具有比抑肌素前體突變蛋白更強的促進肌肉生長的能力,而該能力的獲得可能是由于Fst1對除抑肌素外的其他轉化生長因子超基因家族成員的功能抑制.抑肌素基因的缺失可以導致