基于血清藥物化學(xué)的維藥媒介成分規(guī)劃研究

基于血清藥物化學(xué)的維藥媒介成分規(guī)劃研究

基于傳統(tǒng)的藥物化學(xué)方法，總結(jié)了不同現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)中藥口服后血液中的滲透成分進(jìn)行了相關(guān)研究，并確定了中藥作為血液中殘留因子的應(yīng)用學(xué)科。該法已經(jīng)成為中藥有效成分研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的重要手段,且對(duì)血清中所含復(fù)方化學(xué)成分進(jìn)一步分析、鑒定,把得到的成分與復(fù)方再次進(jìn)行藥效學(xué)比較,以期揭示產(chǎn)生復(fù)方藥效的成分。驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊[Vernoniaanthelmintica(L.)Willd],為菊科(Compositae)斑鳩菊屬一年生草本植物,別名印度山茴香。新疆和田、阿克蘇和云南西部有栽培。為新疆維吾爾醫(yī)用藥,具有清除異常黏液質(zhì)、驅(qū)蟲(chóng)、消腫、散寒鎮(zhèn)痛等作用,用于治療濕寒性胃痛、肝病、白癜風(fēng)等病癥,治療白癜風(fēng)有突出的療效。對(duì)驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的化學(xué)成分和藥理作用已有研究,但筆者未見(jiàn)應(yīng)用血清藥物化學(xué)方法研究驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的報(bào)道。鑒于此,筆者擬采用血清藥物化學(xué)方法,在建立驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜基礎(chǔ)上,通過(guò)研究比較驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊水提取物、給藥及未給藥大鼠血清的HPLC指紋圖譜,確定驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊血中移行成分,為最終篩選確定驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的藥效成分奠定基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和儀器美國(guó)Waters1525二元泵高效液相色譜儀,Waters2996二極管陣列檢測(cè)器,Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng);Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(18MΩ,Millipore公司);SGT7200HBT型超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);BS110S電子天平(北京賽多利斯有限公司);TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)。驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑室,經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所張彥福研究員鑒定為菊科植物驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊[Vernoniaanthelmintica(L.)Willd]的干燥成熟果實(shí)。乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher公司);甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司);超純水(電阻18MΩ,Millipore公司);磷酸(分析純,天津市化學(xué)試劑三廠);超純氮?dú)?純度≥99.999%,新疆康迪實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。清潔級(jí)Wistar大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,雄性,由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,許可證號(hào):SYXK(新)2003-0003。每組各5只。2流動(dòng)相及洗脫程序Shim-packVP-ODSC18柱(150mm×4.6mm,5μm)。流動(dòng)相:A液為乙腈,B液為0.5%磷酸溶液,梯度洗脫程序:0～70min,10%～32%乙腈;流速:1mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):220nm;柱溫:22℃;進(jìn)樣量:10μL。2.2寄生蟲(chóng)樣品的提取驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材粗粉520g,用水回流提取3次(3次用量依次為藥材的10,8,8倍),3次煎煮時(shí)間分別為2,1,1h。煎液過(guò)濾,濾液減壓濃縮得干浸膏。用純化水100mL配制成含藥量0.72g·mL-1的混懸液,供灌胃用。精密稱取驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊藥材4g,精密稱定,加水40mL,加熱回流提取3次(3次加水量依次為藥材的10,8,8倍),3次煎煮時(shí)間依次為2,1,1h,將各煎煮液過(guò)濾,合并上清液,置100mL量瓶中,用提取溶劑定容至100mL,制得樣品溶液(每毫升相當(dāng)于原藥材0.04g)。取上面所制得的樣品溶液適量,置10mL量瓶中,用提取溶劑定容,溶液過(guò)孔徑0.45μm微孔濾膜,取濾液10μL進(jìn)行HPLC分析。2.3大鼠血清中血清的表達(dá)Wistar大鼠隨機(jī)分為給藥組和空白組,每組5只,禁食12h(自由飲水),給藥組以藥液量20mL·kg-1灌胃,空白組給予同體積的純化水,bid,連續(xù)3d。末次給藥后1.5h,乙醚麻醉,大鼠腹主動(dòng)脈采血,低速離心,分離血清,置-20℃冰箱中冷凍備用。取空白及給藥組血清各2mL,加甲醇10mL,搖勻后,微量振蕩器振蕩5min,放置4～5h,自然沉淀蛋白,吸取上清液,置10mL試管中,用氮?dú)鉂饪s約0.5mL,用甲醇沖洗全部轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中,用氮?dú)獯蹈?殘?jiān)眉状?.2mL溶解(若渾濁可用10000r·min-1,r=10cm),上清液過(guò)孔徑0.45μm濾膜過(guò)濾,取20μL經(jīng)HPLC分析。按液相色譜條件,分別測(cè)定驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清和空白血清的HPLC色譜指紋圖譜。3驗(yàn)證斑鳩菊含藥血清濃度圖1(A～C)分別為驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清和空白血清的HPLC色譜指紋圖譜。由圖1(A)可見(jiàn),驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液共分離得到31個(gè)色譜峰,其中7,12,13,14,15,23,26,27,29號(hào)峰峰面積較大。通過(guò)比較驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清與空白血清,驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清出現(xiàn)了9個(gè)新色譜峰,即1,3,5～11號(hào)峰,結(jié)果見(jiàn)圖1(B,C)。比較驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清和空白血清的HPLC色譜指紋圖譜,含藥血清的1,6,9～11號(hào)峰分別與驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液的7,23,26,27,29號(hào)峰對(duì)應(yīng),說(shuō)明有5種驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的原型成分吸收入血結(jié)果見(jiàn)圖1(A、B、C)。而在圖1(B)中的3,5,7,8號(hào)峰是驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清的特有峰,可能是驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊提取物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。比較圖1(A,B,C)發(fā)現(xiàn),在驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清色譜圖中2,4號(hào)峰位置,驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊供試液和空白血清在相近位置上都出現(xiàn)此峰,該色譜峰僅是血清中的固有成分,還是血清固有成分與驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊原型成分的疊加,有待采用質(zhì)譜及磁共振波譜等檢測(cè)方法做進(jìn)一步考察。4血清成分的檢測(cè)在分析體外生藥樣品和給藥后血清樣品時(shí),均采用了完全相同的色譜條件,因此,兩種樣品的HPLC指紋圖譜中的色譜峰應(yīng)具有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系,同時(shí),對(duì)供試液的穩(wěn)定性、儀器的精密度和測(cè)定方法的重復(fù)性進(jìn)行了考察,均符合相關(guān)要求。實(shí)驗(yàn)中嘗試采用甲醇沉淀法、70%高氯酸沉淀法及熱水浴法對(duì)血清樣品進(jìn)行處理,從對(duì)待測(cè)組分的影響、干擾情況及對(duì)色譜分析條件的影響等方面進(jìn)行考慮,確定采用甲醇沉淀法處理血清樣品,用氮?dú)鉂饪s法富集血中的成分。本研究對(duì)驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊首次采用血清藥物化學(xué)的方法,通過(guò)比較驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊水提取物、驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊含藥血清和空白血清HPLC指紋圖譜的差異,確定9種血中移行成分,其中5種為原型成分,其余4種可能為原型成分的代謝產(chǎn)物。9種入血成分可能是驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的體內(nèi)直接作用物質(zhì),對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于闡明驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊治療白癜風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。5種直接入血成分的性質(zhì)及藥理作用,建議從原藥材中制備分離純化進(jìn)行研究,4種代謝產(chǎn)物及