用aflp技術對中國產六木屬phy作業(yè)種間關系分析

用aflp技術對中國產六木屬phy作業(yè)種間關系分析

喬木r.布朗是東亞和北美之間的段布局（吳正揚，1991）。一般認為,與六道木屬最近緣的屬為北極花屬(LinnaeaL.)和猬實屬(KolkwitziaGraebn.)。六道木屬含兩個組,六道木組(sect.Abelia)和管花六道木組(sect.ZabeliaRehd.),有的學者認為它們是不同的屬(Golubkova,1972;Hara,1983;Ohba,1993;湯彥承和李良千,1994)。六道木組分布于中國、日本和墨西哥。墨西哥產六道木原先認為有2種,近來又增加了3種(Villarreal-Q,1997;Villarreal-Q&Rosa-I,2000),它們屬于墨西哥六道木系(ser.VesaleaeZabel)。六道木組日本產3種,形態(tài)上十分接近,組成黃花六道木系(ser.SerrataeGraebn.)。黃花六道木(AbeliaserrataSieb.etZucc.)長久以來一直被認為是個日本特有種。雖然過去有的中國標本被鑒定成黃花六道木,但都是誤定。Rehder(1911)認為,被鑒定成A.serrata的中國的標本乃A.graebnerianaRehder或A.unifloraR.Brown。然而,根據胡嘉琪(1988)的意見,Rehder提到的A.graebneriana為A.engleriana(Graebn.)Rehd.的異名,而A.uniflora與A.parvifoliaHemsl.形態(tài)上十分相似。黃花六道木與這些種均有明顯的差別,其中最直觀而顯著的差別為花冠的顏色。我們最近在浙江省永嘉縣采集到六道木屬的標本,經鑒定為黃花六道木。中國的六道木屬種類豐富,變異復雜,分類鑒定困難很大,而DNA序列的分辨率低(如ITS序列),不能完全揭示種間關系(待發(fā)表)。為了從整個基因組水平上揭示六道木屬物種的系統(tǒng)關系,我們采用AFLP技術(Vos等,1995),首先對東亞產六道木屬六道木組及其近緣類群的代表種進行分析,目的是(1)探討AFLP在分析種間關系上的適用性;(2)分析六道木屬與近緣的猬實屬的關系;(3)分析六道木組的種間關系;(4)鑒別浙江省永嘉縣采集到六道木屬的標本與日本產A.serrata是否為同一物種。1材料和方法1.1錦帶花屬種抗菌藥dna的合成實驗材料包括六道木屬六道木組(AbeliaR.Br.sectionAbelia)7種11個樣品,管花六道木組(AbeliaR.Br.sectionZabeliaRehd.)2代表物種,猬實屬1種和錦帶花屬1種2份樣品(表1)。DNA從硅膠干燥的葉片用CTAB法提取(Doyle&Doyle,1987)。DNA提取后,用RNase去除RNA,然后用Promega公司的WizardDNAClean-UpSystem(產品編號A7280)純化。純化后DNA的濃度調整為100～150ng/μl。1.2pcr擴增和選擇性擴增AFLP分析采用ABI公司的“AFLPPlantMappingKit”試劑盒(AppliedBiosystems,P/N402004,402005,4303050)。酶解與接頭連接同步進行,總體積為10μl。反應體系為1×T4連接酶緩沖液(含ATP),50mmol/LNaCl,5ngBSA,5單位的EcoRI,1單位的MseI,1Weiss單位的T4DNA連接酶,0.5μmol/LEcoRI接頭,5μmol/LMseI接頭,約0.5μgDNA?；旌弦河?滴礦物油覆蓋,在室溫下過夜。次日用0.1×TE稀釋20倍,存-20℃?zhèn)溆?。預選擇性擴增(Preselectiveamplification)的反應體系為20μl,含15μl的AFLPAmplificationCoreMix,各125μmol/L預選擇性擴增引物,4.0μl稀釋后的酶解與連接產物。PCR反應為2′@72℃,30個循環(huán)的20″@94℃,30″@65℃,2′@72℃,最后在60℃延伸30min。PCR產物用0.1×TE稀釋20倍備用。我們用3種熒光標記的5對引物進行選擇性擴增。引物的組合為EcoR-ACA/Mse-CAC、EcoR-ACT/Mse-CTA、EcoR-AAG/Mse-CAG、EcoR-ACC/Mse-CTG和EcoR-ACC/Mse-CAT。其中EcoR-ACA和EcoR-ACT為FAM標記,EcoR-AAG為JOE標記,EcoR-ACC和EcoR-ACC為NED標記。PCR反應體系為10μl,含7.5μl的“AFLPAmplificationCoreMix”,0.5μl的EcoRI引物,0.5μl的MseI引物,1.5μl的稀釋的預選擇擴增產物。PCR程序為2′@94℃,30″@66℃,頭10個循環(huán)每個循環(huán)退火溫度遞減1℃,直到56℃,后30個循環(huán)維持在56℃,2′@72℃。最后在60℃延伸30min。1.3電泳分離和離子測序選擇性擴增產物用BioWhittakerMolecularApplications公司的LongRangerSingelpacks(cat.#50691)在ABI377自動測序儀上電泳分離和記錄。由ABI377自動測序儀收集的AFLP電泳數字圖象經GeneScan(version3.1)分析,計算出DNA片段的長度并生成樣品文件,樣品文件經Binthere(Garnhart,2000)匯集后輸出DNA片段分子量矩陣,再由MG(Zhou&Qian,2003)計算軟件分析產生0/1數據矩陣后,用NTSYS(Rohlf,1993)分析不同引物組合所獲得的數據之間的相容性,最后以錦帶花屬的兩份樣品為外類群,用PAUP*(Swofford,2001)分析類群之間的系統(tǒng)關系。2點、基地及鄰接法分析5對引物共擴增出988個位點,其中EcoR-ACA/Mse-CAC有217個位點、EcoR-ACT/Mse-CTA有184個位點、EcoR-AAG/Mse-CAG有179個位點、EcoR-ACC/Mse-CTG有239個位點、EcoR-ACC/Mse-CAT有169個位點。5對引物的5組數據之間相容性的Mantel檢驗結果列于表2。兩組數據的相關系數為0.725～0.919,其中EcoR-ACA/Mse-CAC與EcoR-AAG/Mse-CAG的關系示如圖1。16個樣品的988個位點的鄰接法分析生成的樹的各分支,除個別分支外,都得到很高的支持率(圖2)?；?個分支為:(1)外類群錦帶花;(2)管花六道木組兩個種和猬實;(3)六道木組的物種。在六道木組這一支,有兩個分支,一支為黃花六道木系,另一支為糯米條等其他物種。中國產黃花六道木與日本產的兩個黃花六道木樣品(Funamoto18和Funamoto20)有比較大的區(qū)別,但與另一個樣品(Funamoto19)的差別較小。3討論3.1aflp的應用分子系統(tǒng)學研究存在兩類困難。其一是穩(wěn)定可靠的標記(如DNA序列)差異小、分辨率低,在屬內種間,情況常常如此。其二是差異大、分辨率高的分子標記(如RADP等)同源性低,同塑性高。AFLP具有多態(tài)性高,重復性好,操作簡便等特點,多用于構建物種的遺傳圖譜、評估遺傳多樣性、分析品種之間的關系等,也有用AFLP分析種間關系的報道(Aggarwal等,1999;Koopman等,2001;Mace等,1999)。當分子標記不能很好地揭示物種之間的關系時,不同的分子標記或同種標記的不同引物所得到的結果不同,數據組間的相關性低。我們用了5對引物對16個樣品進行AFLP分析,獲得的5組數據相互之間的相關系數在0.725以上,表明不同組數據均能很好揭示種間關系,從而證明AFLP可用于種間關系分析。3.2教育觀研究的結論雖然有胡嘉琪等(1982)、徐炳聲(1983)、胡嘉琪(1988)、胡嘉琪和賀超興(1988)對中國產六道木屬的研究,Ohwi&Kitagawa(1992)和Ohba(1993)對日本產六道木屬的研究,Lee(1979)對朝鮮(韓國)六道木屬的研究,以及Villarreal-Q(1997)和Villarreal-Q&Rosa-I(2000)對墨西哥六道木屬的研究,由于這些研究都是區(qū)域性,加上六道木屬形態(tài)變異的復雜性,我們仍難以對六道木屬的物種數目和種間關系作出客觀的估計。六道木屬的兩個組分化顯著,有的學者視它們?yōu)椴煌膶?Ohba,1993;湯彥承和李良千,1994)。在我們的AFLP分析結果(圖2)中,以錦帶花屬為根,兩個分支恰好是六道木屬的兩個組(猬實除外,見下文)。所以,即使將兩個組分別提升為屬,它們仍是姊妹群關系。猬實屬與六道木屬的差別主要是果實類型,前者為兩個果實愈合的堅果,后者為分離的堅果。其實,猬實屬與六道木屬的區(qū)別并不大,除了果實外,其他的形態(tài)特征都十分相似,這也就是Troll&Weberling(1966)和Weberling(1966)懷疑建立猬實屬必要性的原因。我們的研究結果也證明猬實屬與六道木屬的密切關系。鑒于猬實屬獨特的果實類型和它與六道木屬的密切關系,我們懷疑它由雜交起源,六道木屬是其親本之一。然而,這樣的推測仍有待證實。3.3日本產黃花六水品種結構六道木組的7個物種分化為2群。第一群為糯米條、溫州六道木、大花六道木、單花六道木和小葉六道木。糯米條和溫州六道木雖然形態(tài)差異很大,但其遺傳分化很小,DNA序列更是一樣(待發(fā)表)。大花六道木本來是單花六道木與糯米條的雜交種(Rehder,1911),后代在栽培過程中逐漸分離,有的象糯米條,花萼裂片多為5;有的介于兩親本之間,花萼裂片2～5,有的象單花六道木,花萼裂片多為2～3。小葉六道木與單花六道木形態(tài)上十分相似,但遺傳分化較大,單花六道木應能作為獨立的種存在。第二群為日本產的黃花六道木和A.tetrasepala。中國產黃花六道木與日本產黃花六道木在遺傳上有一定的差別。日本產3份黃花六道木樣品間的Dice(1945)遺傳相似性為0.615～0.657,中國產樣品與日本產樣品之間的遺傳相似性在0.548～0.586之間(具體數據沒有給出)。日本產黃花六道木存在比較大的形態(tài)變異,如花序(Fukuoka,1969)、花冠大小和顏色,毛被的疏密等,從ITS序列的雜合性(待發(fā)表)判斷,可能存在與近緣種的雜交現象。黃花六道木中國產與日本產樣品之間在葉、花序、花和果實等分類上十分重要的形態(tài)上尚沒有發(fā)現明顯區(qū)別。另外,由于日本產黃花六道木復雜的變異,AFLP數據并沒有完全解決兩地黃花六道木的關系(如樣品Funamoto19和Zhou2002519,圖2)。所以,在獲得足夠的證據之前,將中國產黃花六道木與日本產黃花六道木視為同一物種更為恰當。除糯米條見于琉球群島外,黃花六道木是六道木屬中日本與中國共有的另一種類。黃花六道木在中國的發(fā)現又一次證明中日植物區(qū)系的密切關系。隨著研究的深入,會有更多的證據證明這一點。3.4冠狀帶裂緣物,形態(tài)黃花六道木新擬圖3:1,2AbeliaserrataSieb.etZucc,Fl.Japon.I.76.t.34,1835.落葉灌木,高達3m,地徑達4cm。樹皮灰色,縱裂。小枝栗色,被短柔毛。葉對生,卵形,先端尖至漸尖,基部楔形,全緣或有稀疏鋸齒,有緣毛,下面淡綠色。葉片長53±5mm,寬24±3mm,幼時兩面有稀疏柔毛,脈上毛較密。側脈2～3對。聚傘花序1～2花,生于新枝頂端,總花梗2～3mm?；o梗,苞片3枚,長2～3mm,寬不足1mm,披針形。萼筒條形,長約8～10mm,有短柔毛。萼檐2裂,有時其中一枚再深裂而為3枚,長10±1mm,寬6±1mm,矩圓形,先端有裂齒?；ü诼┒窢?黃色或黃綠色?；ü谕查L18±1mm,口部直徑約8mm?；ü诹哑雸A形?；ü谕埠突ü诹哑瑑让嬗虚L柔毛和桔黃色紋。雄蕊4,2強,著生于花冠筒中部,略伸出花冠筒外?；ㄖ?柱頭膨大,高于雄蕊群。花期5月,果期9月。Zhejiang(浙江):Yongjia(永嘉),S.L.Zhou(周世良)andS.T.Lu(陸水土)20006102(PE),S.L.Zhou(周世良)2002519(PE);thesamelocality(同一地點),C.S.Ding(丁陳森)etal.1087(ZJFC),S.L.Zhou(周世良)0473(ZJFC),C.S.Ding(丁陳森)&G.Y.Li(李根有)1241(ZJFC)。分布于浙江省永嘉縣四海山(28°30′41″N,120°43′43″E,931m),生于山脊側面浙江水青岡(FagushayataePalib.exHayatavar.zhejiangensisM.C.LiuetM.H.WuexY.T.Change