用aflp技術(shù)對(duì)中國產(chǎn)六木屬phy作業(yè)種間關(guān)系分析

用aflp技術(shù)對(duì)中國產(chǎn)六木屬phy作業(yè)種間關(guān)系分析

喬木r.布朗是東亞和北美之間的段布局（吳正揚(yáng)，1991）。一般認(rèn)為,與六道木屬最近緣的屬為北極花屬(LinnaeaL.)和猬實(shí)屬(KolkwitziaGraebn.)。六道木屬含兩個(gè)組,六道木組(sect.Abelia)和管花六道木組(sect.ZabeliaRehd.),有的學(xué)者認(rèn)為它們是不同的屬(Golubkova,1972;Hara,1983;Ohba,1993;湯彥承和李良千,1994)。六道木組分布于中國、日本和墨西哥。墨西哥產(chǎn)六道木原先認(rèn)為有2種,近來又增加了3種(Villarreal-Q,1997;Villarreal-Q&Rosa-I,2000),它們屬于墨西哥六道木系(ser.VesaleaeZabel)。六道木組日本產(chǎn)3種,形態(tài)上十分接近,組成黃花六道木系(ser.SerrataeGraebn.)。黃花六道木(AbeliaserrataSieb.etZucc.)長久以來一直被認(rèn)為是個(gè)日本特有種。雖然過去有的中國標(biāo)本被鑒定成黃花六道木,但都是誤定。Rehder(1911)認(rèn)為,被鑒定成A.serrata的中國的標(biāo)本乃A.graebnerianaRehder或A.unifloraR.Brown。然而,根據(jù)胡嘉琪(1988)的意見,Rehder提到的A.graebneriana為A.engleriana(Graebn.)Rehd.的異名,而A.uniflora與A.parvifoliaHemsl.形態(tài)上十分相似。黃花六道木與這些種均有明顯的差別,其中最直觀而顯著的差別為花冠的顏色。我們最近在浙江省永嘉縣采集到六道木屬的標(biāo)本,經(jīng)鑒定為黃花六道木。中國的六道木屬種類豐富,變異復(fù)雜,分類鑒定困難很大,而DNA序列的分辨率低(如ITS序列),不能完全揭示種間關(guān)系(待發(fā)表)。為了從整個(gè)基因組水平上揭示六道木屬物種的系統(tǒng)關(guān)系,我們采用AFLP技術(shù)(Vos等,1995),首先對(duì)東亞產(chǎn)六道木屬六道木組及其近緣類群的代表種進(jìn)行分析,目的是(1)探討AFLP在分析種間關(guān)系上的適用性;(2)分析六道木屬與近緣的猬實(shí)屬的關(guān)系;(3)分析六道木組的種間關(guān)系;(4)鑒別浙江省永嘉縣采集到六道木屬的標(biāo)本與日本產(chǎn)A.serrata是否為同一物種。1材料和方法1.1錦帶花屬種抗菌藥dna的合成實(shí)驗(yàn)材料包括六道木屬六道木組(AbeliaR.Br.sectionAbelia)7種11個(gè)樣品,管花六道木組(AbeliaR.Br.sectionZabeliaRehd.)2代表物種,猬實(shí)屬1種和錦帶花屬1種2份樣品(表1)。DNA從硅膠干燥的葉片用CTAB法提取(Doyle&Doyle,1987)。DNA提取后,用RNase去除RNA,然后用Promega公司的WizardDNAClean-UpSystem(產(chǎn)品編號(hào)A7280)純化。純化后DNA的濃度調(diào)整為100～150ng/μl。1.2pcr擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增AFLP分析采用ABI公司的“AFLPPlantMappingKit”試劑盒(AppliedBiosystems,P/N402004,402005,4303050)。酶解與接頭連接同步進(jìn)行,總體積為10μl。反應(yīng)體系為1×T4連接酶緩沖液(含ATP),50mmol/LNaCl,5ngBSA,5單位的EcoRI,1單位的MseI,1Weiss單位的T4DNA連接酶,0.5μmol/LEcoRI接頭,5μmol/LMseI接頭,約0.5μgDNA?；旌弦河?滴礦物油覆蓋,在室溫下過夜。次日用0.1×TE稀釋20倍,存-20℃?zhèn)溆?。預(yù)選擇性擴(kuò)增(Preselectiveamplification)的反應(yīng)體系為20μl,含15μl的AFLPAmplificationCoreMix,各125μmol/L預(yù)選擇性擴(kuò)增引物,4.0μl稀釋后的酶解與連接產(chǎn)物。PCR反應(yīng)為2′@72℃,30個(gè)循環(huán)的20″@94℃,30″@65℃,2′@72℃,最后在60℃延伸30min。PCR產(chǎn)物用0.1×TE稀釋20倍備用。我們用3種熒光標(biāo)記的5對(duì)引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。引物的組合為EcoR-ACA/Mse-CAC、EcoR-ACT/Mse-CTA、EcoR-AAG/Mse-CAG、EcoR-ACC/Mse-CTG和EcoR-ACC/Mse-CAT。其中EcoR-ACA和EcoR-ACT為FAM標(biāo)記,EcoR-AAG為JOE標(biāo)記,EcoR-ACC和EcoR-ACC為NED標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系為10μl,含7.5μl的“AFLPAmplificationCoreMix”,0.5μl的EcoRI引物,0.5μl的MseI引物,1.5μl的稀釋的預(yù)選擇擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR程序?yàn)?′@94℃,30″@66℃,頭10個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減1℃,直到56℃,后30個(gè)循環(huán)維持在56℃,2′@72℃。最后在60℃延伸30min。1.3電泳分離和離子測序選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用BioWhittakerMolecularApplications公司的LongRangerSingelpacks(cat.#50691)在ABI377自動(dòng)測序儀上電泳分離和記錄。由ABI377自動(dòng)測序儀收集的AFLP電泳數(shù)字圖象經(jīng)GeneScan(version3.1)分析,計(jì)算出DNA片段的長度并生成樣品文件,樣品文件經(jīng)Binthere(Garnhart,2000)匯集后輸出DNA片段分子量矩陣,再由MG(Zhou&Qian,2003)計(jì)算軟件分析產(chǎn)生0/1數(shù)據(jù)矩陣后,用NTSYS(Rohlf,1993)分析不同引物組合所獲得的數(shù)據(jù)之間的相容性,最后以錦帶花屬的兩份樣品為外類群,用PAUP*(Swofford,2001)分析類群之間的系統(tǒng)關(guān)系。2點(diǎn)、基地及鄰接法分析5對(duì)引物共擴(kuò)增出988個(gè)位點(diǎn),其中EcoR-ACA/Mse-CAC有217個(gè)位點(diǎn)、EcoR-ACT/Mse-CTA有184個(gè)位點(diǎn)、EcoR-AAG/Mse-CAG有179個(gè)位點(diǎn)、EcoR-ACC/Mse-CTG有239個(gè)位點(diǎn)、EcoR-ACC/Mse-CAT有169個(gè)位點(diǎn)。5對(duì)引物的5組數(shù)據(jù)之間相容性的Mantel檢驗(yàn)結(jié)果列于表2。兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)為0.725～0.919,其中EcoR-ACA/Mse-CAC與EcoR-AAG/Mse-CAG的關(guān)系示如圖1。16個(gè)樣品的988個(gè)位點(diǎn)的鄰接法分析生成的樹的各分支,除個(gè)別分支外,都得到很高的支持率(圖2)?；?個(gè)分支為:(1)外類群錦帶花;(2)管花六道木組兩個(gè)種和猬實(shí);(3)六道木組的物種。在六道木組這一支,有兩個(gè)分支,一支為黃花六道木系,另一支為糯米條等其他物種。中國產(chǎn)黃花六道木與日本產(chǎn)的兩個(gè)黃花六道木樣品(Funamoto18和Funamoto20)有比較大的區(qū)別,但與另一個(gè)樣品(Funamoto19)的差別較小。3討論3.1aflp的應(yīng)用分子系統(tǒng)學(xué)研究存在兩類困難。其一是穩(wěn)定可靠的標(biāo)記(如DNA序列)差異小、分辨率低,在屬內(nèi)種間,情況常常如此。其二是差異大、分辨率高的分子標(biāo)記(如RADP等)同源性低,同塑性高。AFLP具有多態(tài)性高,重復(fù)性好,操作簡便等特點(diǎn),多用于構(gòu)建物種的遺傳圖譜、評(píng)估遺傳多樣性、分析品種之間的關(guān)系等,也有用AFLP分析種間關(guān)系的報(bào)道(Aggarwal等,1999;Koopman等,2001;Mace等,1999)。當(dāng)分子標(biāo)記不能很好地揭示物種之間的關(guān)系時(shí),不同的分子標(biāo)記或同種標(biāo)記的不同引物所得到的結(jié)果不同,數(shù)據(jù)組間的相關(guān)性低。我們用了5對(duì)引物對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行AFLP分析,獲得的5組數(shù)據(jù)相互之間的相關(guān)系數(shù)在0.725以上,表明不同組數(shù)據(jù)均能很好揭示種間關(guān)系,從而證明AFLP可用于種間關(guān)系分析。3.2教育觀研究的結(jié)論雖然有胡嘉琪等(1982)、徐炳聲(1983)、胡嘉琪(1988)、胡嘉琪和賀超興(1988)對(duì)中國產(chǎn)六道木屬的研究,Ohwi&Kitagawa(1992)和Ohba(1993)對(duì)日本產(chǎn)六道木屬的研究,Lee(1979)對(duì)朝鮮(韓國)六道木屬的研究,以及Villarreal-Q(1997)和Villarreal-Q&Rosa-I(2000)對(duì)墨西哥六道木屬的研究,由于這些研究都是區(qū)域性,加上六道木屬形態(tài)變異的復(fù)雜性,我們?nèi)噪y以對(duì)六道木屬的物種數(shù)目和種間關(guān)系作出客觀的估計(jì)。六道木屬的兩個(gè)組分化顯著,有的學(xué)者視它們?yōu)椴煌膶?Ohba,1993;湯彥承和李良千,1994)。在我們的AFLP分析結(jié)果(圖2)中,以錦帶花屬為根,兩個(gè)分支恰好是六道木屬的兩個(gè)組(猬實(shí)除外,見下文)。所以,即使將兩個(gè)組分別提升為屬,它們?nèi)允擎⒚萌宏P(guān)系。猬實(shí)屬與六道木屬的差別主要是果實(shí)類型,前者為兩個(gè)果實(shí)愈合的堅(jiān)果,后者為分離的堅(jiān)果。其實(shí),猬實(shí)屬與六道木屬的區(qū)別并不大,除了果實(shí)外,其他的形態(tài)特征都十分相似,這也就是Troll&Weberling(1966)和Weberling(1966)懷疑建立猬實(shí)屬必要性的原因。我們的研究結(jié)果也證明猬實(shí)屬與六道木屬的密切關(guān)系。鑒于猬實(shí)屬獨(dú)特的果實(shí)類型和它與六道木屬的密切關(guān)系,我們懷疑它由雜交起源,六道木屬是其親本之一。然而,這樣的推測仍有待證實(shí)。3.3日本產(chǎn)黃花六水品種結(jié)構(gòu)六道木組的7個(gè)物種分化為2群。第一群為糯米條、溫州六道木、大花六道木、單花六道木和小葉六道木。糯米條和溫州六道木雖然形態(tài)差異很大,但其遺傳分化很小,DNA序列更是一樣(待發(fā)表)。大花六道木本來是單花六道木與糯米條的雜交種(Rehder,1911),后代在栽培過程中逐漸分離,有的象糯米條,花萼裂片多為5;有的介于兩親本之間,花萼裂片2～5,有的象單花六道木,花萼裂片多為2～3。小葉六道木與單花六道木形態(tài)上十分相似,但遺傳分化較大,單花六道木應(yīng)能作為獨(dú)立的種存在。第二群為日本產(chǎn)的黃花六道木和A.tetrasepala。中國產(chǎn)黃花六道木與日本產(chǎn)黃花六道木在遺傳上有一定的差別。日本產(chǎn)3份黃花六道木樣品間的Dice(1945)遺傳相似性為0.615～0.657,中國產(chǎn)樣品與日本產(chǎn)樣品之間的遺傳相似性在0.548～0.586之間(具體數(shù)據(jù)沒有給出)。日本產(chǎn)黃花六道木存在比較大的形態(tài)變異,如花序(Fukuoka,1969)、花冠大小和顏色,毛被的疏密等,從ITS序列的雜合性(待發(fā)表)判斷,可能存在與近緣種的雜交現(xiàn)象。黃花六道木中國產(chǎn)與日本產(chǎn)樣品之間在葉、花序、花和果實(shí)等分類上十分重要的形態(tài)上尚沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。另外,由于日本產(chǎn)黃花六道木復(fù)雜的變異,AFLP數(shù)據(jù)并沒有完全解決兩地黃花六道木的關(guān)系(如樣品Funamoto19和Zhou2002519,圖2)。所以,在獲得足夠的證據(jù)之前,將中國產(chǎn)黃花六道木與日本產(chǎn)黃花六道木視為同一物種更為恰當(dāng)。除糯米條見于琉球群島外,黃花六道木是六道木屬中日本與中國共有的另一種類。黃花六道木在中國的發(fā)現(xiàn)又一次證明中日植物區(qū)系的密切關(guān)系。隨著研究的深入,會(huì)有更多的證據(jù)證明這一點(diǎn)。3.4冠狀帶裂緣物,形態(tài)黃花六道木新擬圖3:1,2AbeliaserrataSieb.etZucc,Fl.Japon.I.76.t.34,1835.落葉灌木,高達(dá)3m,地徑達(dá)4cm。樹皮灰色,縱裂。小枝栗色,被短柔毛。葉對(duì)生,卵形,先端尖至漸尖,基部楔形,全緣或有稀疏鋸齒,有緣毛,下面淡綠色。葉片長53±5mm,寬24±3mm,幼時(shí)兩面有稀疏柔毛,脈上毛較密。側(cè)脈2～3對(duì)。聚傘花序1～2花,生于新枝頂端,總花梗2～3mm?；o梗,苞片3枚,長2～3mm,寬不足1mm,披針形。萼筒條形,長約8～10mm,有短柔毛。萼檐2裂,有時(shí)其中一枚再深裂而為3枚,長10±1mm,寬6±1mm,矩圓形,先端有裂齒?；ü诼┒窢?黃色或黃綠色?；ü谕查L18±1mm,口部直徑約8mm。花冠裂片半圓形?；ü谕埠突ü诹哑瑑?nèi)面有長柔毛和桔黃色紋。雄蕊4,2強(qiáng),著生于花冠筒中部,略伸出花冠筒外?；ㄖ?xì),柱頭膨大,高于雄蕊群?；ㄆ?月,果期9月。Zhejiang(浙江):Yongjia(永嘉),S.L.Zhou(周世良)andS.T.Lu(陸水土)20006102(PE),S.L.Zhou(周世良)2002519(PE);thesamelocality(同一地點(diǎn)),C.S.Ding(丁陳森)etal.1087(ZJFC),S.L.Zhou(周世良)0473(ZJFC),C.S.Ding(丁陳森)&G.Y.Li(李根有)1241(ZJFC)。分布于浙江省永嘉縣四海山(28°30′41″N,120°43′43″E,931m),生于山脊側(cè)面浙江水青岡(FagushayataePalib.exHayatavar.zhejiangensisM.C.LiuetM.H.WuexY.T.Change