征求意見稿-畜禽肉中食源性興奮劑和孕激素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

本文件規(guī)定了畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量測定的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。本文件適用于雞肉等畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過本文的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中凡是注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義4方法原理樣品中的被測物經(jīng)0.5%乙酸乙腈溶液震蕩提取，加入氯化鈉和無水硫酸鎂脫水離心。上清液采用PSA、C18、中性氧化鋁和無水硫酸鎂凈化。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑和材料除另有說明外，所用試劑均為優(yōu)級純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水5.1試劑5.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.2乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.3無水硫酸鎂（MgSO4）：分析純。5.1.4無水氯化鈉（NaCl）：分析純。5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級純。5.1.6甲酸（HCOOH）：優(yōu)級純。5.1.7乙酸銨（CH3COONH4優(yōu)級純。5.1.8中性氧化鋁（Al(OH)3）：100~200目，層析用。5.1.9N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料（PSA）：40μm~60μm。5.1.10十八烷基鍵合硅膠吸附材料（C1840μm~60μm。5.2溶液配制5.2.10.5%乙酸乙腈溶液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混勻即可5.2.20.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液：稱取0.385g乙酸銨用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。5.2.3復(fù)溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.2.2）90mL，加入10mL甲醇混勻。5.3標(biāo)準(zhǔn)品45種被測化合物（純度≥98%）和9種內(nèi)標(biāo)物的的中英文名稱和CAS號信息見附錄A。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取附錄A中的標(biāo)準(zhǔn)品適量（相當(dāng)于各活性成分10mg），精密稱定，分別用甲醇適量使溶解并定容于10mL，配置成濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。在-18℃以下避光儲(chǔ)存。5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：按照附錄B依據(jù)化合物的類別將被測物分成7組，用甲醇配置成7個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均在-18℃以下避光儲(chǔ)存。5.4.3內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：取組7內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇配置成100ng/mL~400ng/mL的內(nèi)標(biāo)混合中間液，見附錄B。5.4.4外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：臨用前分別取上述1-6組混合儲(chǔ)備液1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配置成外標(biāo)混合中間液，濃度范圍時(shí)100ng/mL~400ng/mL，見附錄B。5.4.5系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取一定量外標(biāo)混合中間液用基質(zhì)空白提取液逐級稀釋，并向其中添加等量的內(nèi)標(biāo)混合中間液。5.5材料5.5.1凈化管：分別稱取吸附材料PSA（5.1.9）、C18（5.1.10）、中性氧化鋁（5.1.8）各165mg，無水硫酸鎂（5.1.3）900mg于10mL螺蓋離心管中。5.5.2微孔濾膜：有機(jī)系，0.22μm。6儀器和設(shè)備6.1超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）；6.2離心機(jī)；6.3氮?dú)獯蹈蓛x；6.4超聲波清洗器；6.5振蕩器；6.6分析天平：感量0.01g和0.00001g。7試樣制備和保存7.1試樣制備肉類樣品各約500g，放入組織搗碎機(jī)均質(zhì)，充分混勻，均分成2份，分別裝入清潔容器內(nèi)，并標(biāo)明標(biāo)記。7.2試樣保存試樣于-20℃以下條件下保存。8測定步驟8.1樣品的處理8.1.1提取準(zhǔn)確稱取粉碎均質(zhì)后的豬肉樣品5.0g（精確至0.01g）于50mL螺蓋離心管中，加入40μL混合內(nèi)標(biāo)中間液（5.4.3加入5mL水，渦旋10s后，準(zhǔn)確加入20mL含0.5%乙酸乙腈溶液（5.2.1振蕩提取15min，加入1.0g氯化鈉和4.0g無水硫酸鎂，快速混勻，繼續(xù)振蕩10min，8000r/min離心5min。8.1.2凈化移取上清液10mL于裝入凈化劑的凈化管中（5.5.1），振蕩10min，8000轉(zhuǎn)/min離心5min。準(zhǔn)確移取上清液5mL，置于氮?dú)獯蹈蓛x上45℃吹干，加入1.0mL復(fù)溶液（5.2.3），渦旋復(fù)溶，用0.22μm微孔濾膜過濾，待上機(jī)測定。8.1.3基質(zhì)空白提取液的制備稱取不含被測物的陰性肉樣品5.0g（精確至0.01g），不加內(nèi)標(biāo)，按照8.1.1和8.1.2的方法進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)提取液，用于配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。8.2空白試驗(yàn)不稱取試樣，按7.1.2和7.1.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。8.3儀器分析條件8.3.1液相色譜條件a)色譜柱：WatersAcquityBEHC18反相液相色譜柱（2.1mm×10mm,1.7μm）或同等柱；b)柱溫：30℃;c)進(jìn)樣量：5μL；d)流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.2.2），B為甲醇（5.1.1）。梯度洗脫條件見表1。表1HPLC梯度洗脫條件時(shí)間（min）A（%）B（%）00.39550.50.39550.3906.00.330708.00.3209.00.300.300.39550.39558.3.2質(zhì)譜條件a)電離源：電噴霧正離子模式（ESI+）；b)檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；c)毛細(xì)管電壓：0.5kV；d)錐孔電壓：30V；e)脫溶劑氣流速度：650L/h；f)脫溶劑氣溫度：450℃;g)錐孔氣流速：150L/h。h)45種目標(biāo)化合物及9種內(nèi)標(biāo)物色譜峰的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見附錄C，標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄D。8.4定性判定用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對試樣進(jìn)行定性判定，在相同試驗(yàn)條件下，樣液譜圖中應(yīng)呈現(xiàn)定量離子對和定性離子對的色譜峰，被測物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比的偏差不超過表2規(guī)定范圍，則可以判斷試樣中存在對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。…（1）表…（1）相對離子豐度/%>5020~50（含）10~20（含）≤10允許的相對偏差/%±20±25±30±508.5定量測定在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，將5μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.4.5）按濃度從低到高的順序依次注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄峰面積、保留時(shí)間等信息。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)物峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品溶液進(jìn)行定量，計(jì)算試樣目標(biāo)物的上機(jī)濃度。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)，如果樣液含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則應(yīng)重新取樣測定。9結(jié)果計(jì)算和表述試樣中各被測物含量按照式（1）計(jì)算：X=式中: mX——樣品中待測組分的含量，單位為微克每千克(μg/kg）；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的目標(biāo)化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——濃縮至干后試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品的稱樣量，單位為克（g）；4——前處理過程引入的稀釋因子。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留一位小數(shù)。10方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度10.1準(zhǔn)確度本方法的回收率范圍是60%~120%。10.2精密度本方法的批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%,批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。10.3靈敏度當(dāng)稱樣量為5.0g時(shí)，本方法的定量限見附錄D。序號中文通用名稱英文通用名稱CAS號分子式1克倫特羅clenbuterol37148-27-9C12H18Cl2N2O2妥布特羅tulobuterol41570-61-0C12H18ClNO3班布特羅bambuterol81732-65-2C18H29N3O54克倫丙羅clenproperol38339-11-6C11H16Cl2N2O5噴布特羅penbuterol36507-48-9C18H29NO26克倫塞羅clencyclohexerol157877-79-7C14H20Cl2N2O7馬布特羅mabuterol56341-08-3C13H18ClF3N2O8溴布特羅brombuterol41937-02-4C12H18Br2N2O9西馬特羅cimaterol54239-37-1C12H17N3O氯丙那林clorprenaline3811-25-4C11H16ClNO奧西那林metaproterenol586-06-1C11H17NO3沙丁胺醇salbutamol18559-94-9C13H21NO3齊帕特羅zilpaterol117827-79-9C14H19N3O2萊克多巴胺ractopamine97825-25-7C18H23NO3沙美特羅salmeterol89365-50-4C25H37NO4阿替洛爾atenolol29122-68-7C14H22N2O3普萘洛爾propranolol525-66-6C16H21NO2美托洛爾metoprolol37350-58-6C15H25NO3氨苯喋啶triamterene396-01-0C12H11N720螺內(nèi)酯spironolactone52-01-7C24H32O4S21坎利酮canrenone976-71-6C22H28O322睪酮testosterone58-22-0C19H28O223諾龍nortestosterone434-22-0C18H26O224去氫甲睪酮methandienone72-63-9C20H28O225勃地酮boldenone846-48-0C19H26O226群勃龍trenbolone10161-33-8C18H22O227雄烯二酮4-androstene-363-05-8C19H26O228脫氫表雄酮prasterone53-43-0C19H28O229甲基睪酮methyltestosteroneC20H30O2序號中文通用名稱英文通用名稱CAS號分子式30美睪酮mesterolone1424-00-6C20H32O231美雄諾龍mestanoloneC20H32O232司坦唑醇stanozolol10418-03-8C21H32N2O33地塞米松dexamethasone50-02-2C22H29FO534氫化可的松hydrocortisone50-23-7C21H30O535波尼松龍prednisolone50-24-8C21H28O536可的松cortisone53-06-5C21H28O537波尼松prednisone53-03-2C21H26O538醋酸氟輕松fluocinoloneacetonide67-73-2C24H30F2O639氟氫可的松fludrocortisone127-31-1C21H29FO540倍氯米松beclomethasone4419-39-0C22H29ClO541孕酮progesterone57-83-0C21H30O242醋酸美倫孕酮melengestrolacetate2919-66-6C25H32O443醋酸甲羥孕酮medroxyprogesteroneacetate71-58-9C24H34O44417α-羥孕酮17α-Hydroxyprogesterone68-96-2C21H30O345甲地孕酮megestrol3562-63-8C22H30O3I-1克倫特羅-D9clenbuterol-D9129138-58-5C12H9D9Cl2N2OI-2萊克多巴胺-D5ractopamine-D590274-24-1C18H18D5NO3I-3沙丁胺醇-D3salbutamol-D31219798-60-3C13H19D3NO3I-4甲基睪酮-D3methyltestosterone-D396425-03-5C20H27D3O2I-5睪酮-D3testosterone-D377546-39-5C19H25D3O2I-6勃地酮-D3boldenone-D3361432-76-0C19H23D3O2I-7孕酮-D9progesterone-D915775-74-3C21H21D9O2I-8氫化可的松-D3hydrocortisone-D3115699-92-8C21H27D3O5I-9地塞米松-D5dexamethasone-D5358731-91-6C22H24D5FO5序號被測化合物儲(chǔ)備液濃度(μg/mL）中間液濃度（ng/mL）組別對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物1克倫特羅1克倫特羅-D92妥布特羅13班布特羅14克倫丙羅22005噴布特羅16克倫塞羅17馬布特羅22008溴布特羅19西馬特羅2200氯丙那林1奧西那林1沙丁胺醇1沙丁胺醇-D3齊帕特羅1萊克多巴胺1萊克多巴胺-D5沙美特羅1阿替洛爾1克倫特羅-D9普萘洛爾1美托洛爾1氨苯喋啶2200萊克多巴胺-D520螺內(nèi)酯2200勃地酮-D321坎利酮2200睪酮-D322睪酮220023諾龍220024去氫甲睪酮220025勃地酮2200勃地酮-D326群勃龍220027雄烯二酮2200序號被測化合物儲(chǔ)備液濃度(μg/mL）中間液濃度（ng/mL）組別對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物28脫氫表雄酮2200甲基睪酮-D329甲基睪酮220030美睪酮820031美雄諾龍2200孕酮-D932司坦唑醇2200地塞米松-D533地塞米松4400氫化可的松-D334氫化可的松440035波尼松龍440036可的松440037波尼松440038醋酸氟輕松440039氟氫可的松440040倍氯米松4400孕酮-D941孕酮220042醋酸美倫孕酮220043醋酸甲羥孕酮2200睪酮-D34417α-羥孕酮2200甲基睪酮-D345甲地孕酮2200I-1克倫特羅-D91/I-2萊克多巴胺-D51/I-3沙丁胺醇-D31/I-4甲基睪酮-D32200/I-5睪酮-D32200/I-6勃地酮-D32200/I-7孕酮-D92200/I-8氫化可的松-D34400/I-9地塞米松-D54400/序號目標(biāo)化合物保留時(shí)間(min)母離子(m/z)子離子碰撞能(V)碎裂電壓(V)1克倫特羅4.56277.42634203.12妥布特羅4.97228.4172.2*3班布特羅368.772.2*34294.4204克倫丙羅2.83263.3203.1*26265噴布特羅7.31292.5236.3*7274.2206克倫塞羅3.81319.4203.1*203681.1267馬布特羅5.02311.4217.2*2420237.28溴布特羅4.96367.4132.3*4626293.19西馬特羅2.64220.4160.2*24氯丙那林4.51214.3154.2*26奧西那林2.20212.32220沙丁胺醇2.86240.4148.2*齊帕特羅2.82262.4185.2*24202.2萊克多巴胺4.21302.52626沙美特羅7.31416.791.2*3825380.6阿替洛爾2.87267.4145.2*262074.222普萘洛爾5.94260.4183.2*序號目標(biāo)化合物保留時(shí)間(min)母離子(m/z)子離子碰撞能(V)碎裂電壓(V)美托洛爾4.75268.5氨苯喋啶4.43254.4443820螺內(nèi)酯7.10341.5107.2*264891.14821坎利酮341.5107.2*285891.15222睪酮7.49289.520482223諾龍7.20275.5109.2*282239.324去氫甲睪酮7.31301.5262625勃地酮7.06287.5263026群勃龍6.98271.4199.2*22624427雄烯二酮7.19287.597.2*20342428脫氫表雄酮7.49289