微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)-用

到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲(chóng)、單細(xì)胞藻類等微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻、放線菌原核細(xì)胞微生物的類群課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用1.提供營(yíng)養(yǎng)和條件2.防止污染一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽⑴碳源無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源(1)pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性(2)特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)----維生素、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無(wú)氧的條件2.培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件生長(zhǎng)因子3.種類：固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無(wú)凝固劑瓊脂物理性質(zhì)：菌落單個(gè)或少數(shù)菌體特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。功能：定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體形態(tài)各異的菌落其它分類：根據(jù)化學(xué)成分分合成培養(yǎng)基——成分明確天然培養(yǎng)基——成分不明確根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？練習(xí)1（多項(xiàng)選擇）1、下列細(xì)菌中，能利用含碳無(wú)機(jī)物作碳源的是A光合細(xì)菌B根瘤菌C硝化細(xì)菌D乳酸菌2、培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中，必需含有的碳源和氮源是A糖、有機(jī)酸等B二氧化碳、碳酸鹽C蛋白質(zhì)D無(wú)機(jī)氮化物3、下列敘述不正確的是A培養(yǎng)基是為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)B液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基所含的最基本物質(zhì)不相同C微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，可以形成肉眼可見(jiàn)的單個(gè)細(xì)菌A.CA.CB.C.1.無(wú)菌范圍：實(shí)驗(yàn)操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實(shí)驗(yàn)用具、培養(yǎng)基滅菌實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程酒精燈旁操作超凈工作臺(tái)二.無(wú)菌技術(shù)：防止外來(lái)雜菌的污染耐高溫需保持干燥的物品，160～170℃1～2小時(shí)接種環(huán)、接種針等金屬用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121℃、15～30min二.無(wú)菌技術(shù)：防止外來(lái)雜菌的污染2.消毒與滅菌：思考:1)無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？

2)消毒和滅菌有何不同？3)為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。①培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿②玻棒、試管、燒瓶和吸管③實(shí)驗(yàn)操作者的雙手消毒滅菌條件溫和強(qiáng)烈作用范圍物體表面或內(nèi)部一部分,不包括芽孢和孢子物體內(nèi)外所有微生物,包括芽孢和孢子無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。滅菌滅菌消毒營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞培養(yǎng)基培養(yǎng)皿空氣接種環(huán)雙手牛奶②巴氏消毒③化學(xué)消毒⑤紫外線消毒⑥高壓蒸氣滅菌①灼燒滅菌④干熱滅菌常用的消毒方法和滅菌方法1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g三.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落冷卻至50℃，在酒精燈火焰附近倒平板?思考1溶化時(shí)為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?

答:②加瓊脂的目的是什么?答:可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差作為凝固劑思考2在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？答:

②培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？答:?在滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞,在取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用不能,因?yàn)榕囵B(yǎng)皿要保持干燥,應(yīng)該用干熱滅菌.討論:(1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？(2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？(3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？(4).在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個(gè)平板1個(gè)不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）平板劃線法：稀釋涂布平板法問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。6支試管，分別加入9ml無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過(guò)0.1ml各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋10