實(shí)驗(yàn)五 電泳技術(shù) PAGE

1、概述：聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑作用下合成的。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH丙烯酰胺(Acr)N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2聚丙烯酰胺PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用范圍：

聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶二、聚丙烯酰胺凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：

1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑通常采用過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過硫酸銨形成自由基：S2O82-2SO4-這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。.

2.光聚合光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長(zhǎng)的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會(huì)減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)?！?/p>

聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應(yīng)：Ammoniumpersulfate(過硫酸胺,freeradicalinitiator)Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst)生成自由基聚合物單體聚合物橋聯(lián)單體幫助傳遞自由基的催化劑SDS(Sodiumdodecylsulfate)Acrylamide有毒性！油炸薯?xiàng)l中是否含有？-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112■

單體聚合反應(yīng)：聚合反應(yīng)交聯(lián)物構(gòu)成分枝端部自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯(cuò)連接自由基形成聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：

①幾乎無電滲作用。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。③在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。④凝膠孔徑可調(diào)。⑤分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。■

聚合反應(yīng)注意事項(xiàng)：●

APS很容易因受潮而失活■

凝膠聚合的條件：●

凝固時(shí)間與

APS或TEMED量成反比●

聚合程度(%)與溫度成正比但與APS濃度無關(guān)凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計(jì)算公式分別為：T=C=凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時(shí)，凝膠具有最小孔徑，超過5%或低于5%時(shí)凝膠孔徑都要增大。三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%在濃度為7.5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對(duì)于一個(gè)未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%的凝膠梯度來測(cè)試，而后選出適宜的凝膠濃度。

聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的組成：聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力?！?/p>

聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH凝膠濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液

2樣品溶液3濃縮膠

6.9

4分離膠凝膠

5下層(正極)

緩沖液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

凝膠不連續(xù)性具有濃縮樣品的的作用■垂直柱狀電泳槽：LowerchamberUpperchamber+-+CoolingWaterRunningGelStackingGel電泳開始100~150V在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場(chǎng)向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。濃縮效應(yīng)：■在濃縮膠中的三個(gè)主要影響因素：Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子■濃縮膠對(duì)蛋白質(zhì)分子的濃縮作用：分離膠濃縮膠樣品8.96.9離子缺乏空間ABC++8.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SDS)

■

SDS在蛋白質(zhì)表面均勻帶上

一層負(fù)電：SDSboiling變性后的蛋白質(zhì)成一線形分子天然蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負(fù)電荷非極性尾部極性頭部■三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較：Molecular

WeightpINative

PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary

StructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+XYZ+SDSNativeSDS分子量及凈電荷數(shù)量均可影響泳動(dòng)率只有分子量影響泳動(dòng)率XYZ-+-■

天然蛋白分子量測(cè)定：DisckD669440232140kD900800700600500400300200100Migration(cm)1234SS●

不能以disc為唯一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)依據(jù)Molmass■

蛋白質(zhì)單體分子量的測(cè)定：SDS0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresis■凝膠過濾層析的洗脫圖譜：XYZEEnzymeactivityElutionVolume(mL)AVoVeVt0■

凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)的洗脫：●直接挖出凝膠進(jìn)行洗脫LittleBlueTank