專題1基因工程-11.2基因工程的基本操作程序

專題1基因工程1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序獲取目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因檢測與鑒定第一步第二步第三步第四步基因工程的基本操作流程圖一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘蝎@取目的基因1.基因組文庫將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。2.部分基因文庫受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如cDNA文庫。3.基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動子原核真核結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.原理

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),它是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因為整個過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。2.過程高溫變性（90~95℃）低溫退火（55~60℃）中溫延伸（70~75℃）雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個過程不需要解旋酶。多次重復(fù)3.特點：指數(shù)形式擴(kuò)增（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建用限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子，即基因表達(dá)載體。質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA（一）構(gòu)建目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（二）構(gòu)建零件及其作用1.目的基因2.啟動子RNA聚合酶識別和結(jié)合的一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)。3.終止子一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。4.標(biāo)記基因鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。

基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動植物細(xì)胞等。導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑，且因受體細(xì)胞的不同而不同。1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞2.其他方法（見教材P12“生物技術(shù)資料卡”）（1）基因槍法（2）花粉管通道法（適用于雙子葉植物和裸子植物）適用于單子葉植物（二）導(dǎo)入動物細(xì)胞顯微注射技術(shù)含目的基因的表達(dá)載體動物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動物顯微注射分裂分化移植發(fā)育問題為什么將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用的受體細(xì)胞是受精卵？（三）導(dǎo)入微生物細(xì)胞2.優(yōu)點繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、操作簡單、價格低廉。3.常用受體細(xì)胞大腸桿菌（E.coli）1.過程（1）制備感受態(tài)細(xì)胞：用Ca2+（CaCl2）處理細(xì)菌，使細(xì)菌易于接受外源DNA分子。（2）重組DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合孵育，完成轉(zhuǎn)化。Ca2+處理法四、目的基因的檢測與鑒定目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢測、鑒定才能得知。常用的檢測手段主要從分子水平和個體水平進(jìn)行。（一）分子水平1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因提取受體生物全部DNA適當(dāng)限制酶切割DNA片段用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術(shù)2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA提取受體生物的mRNA用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA）檢測DNA利用的是DNA與DNA雜交，檢測mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。3.檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交技術(shù)提取受體生物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體雜交顯出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）（二）個體水平例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。（1）為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。尋根問底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭議頗多，嚴(yán)格來講不算基因工程。尋根問底：1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。尋根問底：（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。2.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？尋根問底：思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。3.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等