外源基因表達調(diào)控1

第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)的表達調(diào)控引言表達調(diào)控的研究內(nèi)容起始密碼邊周序列（initialcode）翻譯增強因子（Ω

）密碼劑量效應(yīng)(codonbias)

啟動子活性（promoter）增強子（enhancer）Poly(A)信號(signal)內(nèi)含子（intron）不穩(wěn)定因子隱含內(nèi)含子序列隱含Poly(A)信號外源基因在不同水平上的表達調(diào)控整合狀態(tài)基因活性調(diào)控水平DNA水平RNA水平蛋白質(zhì)水平轉(zhuǎn)錄效率轉(zhuǎn)錄加工mRNA穩(wěn)定性翻譯效率翻譯后修飾蛋白質(zhì)運輸整合位置效應(yīng)（positioneffect）拷貝數(shù)影響（copiesnumbers）DNA再分布（DNArearrange）DNA甲基化（DNAmethylation）共抑制和反式失活（cosuppression&trans-inactivity）剪切內(nèi)含子-1葉綠體線粒體核糖基化信號肽第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)的表達調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達1.瞬時表達

概念過程2.瞬時表達的機理

a.瞬時表達是沒有整合的外源基因的表達

b.瞬時表達是一種正常的表達方式3.外源基因瞬時表達的影響因素 （1）質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu) （2）內(nèi)源核酸酶的影響 （3）受體細胞生理狀態(tài) (4)內(nèi)源GUS酶抑制劑4.外源基因瞬時表達的應(yīng)用 （1）在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用

a.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測

b.優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件 （2）植物基因表達調(diào)控的研究5.外源基因的穩(wěn)定表達 外源基因在植物細胞中的穩(wěn)定表達的條件

a.時間長 b.無迅速衰退現(xiàn)象

c.分子雜交證明DNA已經(jīng)整合到植物基因組中

d.能遺傳，并符合分離規(guī)律第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)的表達調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達異源性表達（heterologousexpression)同源性表達（homologousexpression)

異源性表達只是基因編碼序列“異源”，而啟動子和其它調(diào)控序列必須與植物同源二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達1.真核生物基因在植物細胞中的表達 動物基因在植物細胞中不表達的原因a.啟動子不能被植物細胞識別，不能起始轉(zhuǎn)錄（hsp70例外）b.內(nèi)含子序列不同，hnRNA的加工修飾受阻。（雖然內(nèi)含子邊界相同GT/AG，但長度和AT含量不同，植物較短100-200bp,而且AT含量高，因此植物細胞不能切除動物內(nèi)含子）c.動物細胞PolyA信號與植物不同，因此不能有效地識別d.動、植物的翻譯系統(tǒng)的起始序列不同。動物是CACCAUG

植物是AACAAUGGC 所以，當(dāng)用動物基因轉(zhuǎn)化植物時要考慮這些差異，構(gòu)建載體質(zhì)粒時應(yīng)采用植物的調(diào)控序列.二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達2.原核生物基因在植物細胞中的表達

原核與真核基因在表達機制上有很大的差異，因此細菌的基因直接導(dǎo)入植物細胞是不能表達的。即使采用了植物基因的表達調(diào)控系統(tǒng)，沒有改造的細菌基因也只能很低水平的表達。例：Bt.δ-毒蛋白抗蟲基因表達量僅占植物可溶蛋白總量的0.001%達不到抗蟲的目的。原因是，mRNA結(jié)構(gòu)中可能隱含有polyA信號AAUAA序列及內(nèi)含子切割序列等，從而造成mRNA在不適當(dāng)?shù)奈恢蒙蠑嗔讯到狻Ｏ蛑参镏幸隑t基因的改造。在不改變氨基酸序列的情況下，改變了20%的堿基序列，提高了GC含量，使其在植物中的表達由原來的0.001%提高到0.05~0.1%（提高了50-100倍）?？瓜x效果明顯提高。向植物中引入Bt基因的改造修飾原則：1.優(yōu)先使用植物偏愛的密碼子2.改變基因的GC含量（36~45%），使之與植物基因GC含量一致3.注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。對植物而言，該比值低好。Thr,Pro,Ala和Ser密碼子第三位避免用G。4.翻譯起始區(qū)第4個核苷酸用G，以符合ATGGC的要求。5.去除隱含的poly（A）信號。如：AATAA，AATGAA，AATAAT，AATATT，GATAAA，GATAAG6.去除隱含的RNA聚合酶II終止序列。CAN1~9AGTNNAA7.清除發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。CUUCGG8.消除隱含的內(nèi)含子剪切序列。AAG.GTAAGT等

三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點(圖)10三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點2.5’-端表達調(diào)控序列的基本特征

啟動子Promoter

增強子Enhancer

沉默子Silencer

順式作用元件Cis-acting-element

反式作用因子Trans-acting-factor 啟動子 確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列

TATAbox–25~-35負責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的精確性 CAATbox GCbox–80~-110控制轉(zhuǎn)錄起始頻率

多數(shù)組成型啟動子上游有（hexamermotif)TGACTG

可誘導(dǎo)啟動子中常有CCACGTGG8核苷酸G-box植物轉(zhuǎn)錄起始位點處的保守序列:YYYAYYA+1三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響3.啟動子和增強子

增強子的作用是增強RNA的轉(zhuǎn)錄效率，其功能是通過結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子或影響DNA的構(gòu)象而實現(xiàn)的。增強子作用的三個特點： 1.它與啟動子的相對位置和取向無關(guān)，具有遠程效應(yīng) 2.需要特定的蛋白質(zhì)因子的參與 3.有些（如SV40的增強子)能在幾乎所有類型細胞中發(fā)揮 作用，而大多數(shù)具有相對的組織特異性目前已分離的大量的啟動子（包括增強子）按其作用方式大體可劃分為三類組成型 誘導(dǎo)型 組織特異型三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響3.啟動子和增強子（1）組成型啟動子

A.CaMV35S啟動子CaMV35S啟動子二.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響3.啟動子和增強子（1）組成型啟動子

A.CaMV35S啟動子

B.NOS啟動子組成型,損傷,激素誘導(dǎo)活性,-123--114之間或重疊區(qū)有20ntZ-DNA形成因子可以與bZIP蛋白因子相互作用,誘導(dǎo)活性必需序列.啟動子的強度依組織部位及器官位置而變化,老組織中強,生殖器官中隨發(fā)育狀態(tài)而不同.在禾本科植物中完全或幾乎無啟動子表達能力.

TGACGTAAGCACATACGTCA-123~114Z-DNA三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對外源基因表達的影響3.啟動