毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷的含量

毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷的含量【摘要】目的建立梔子金花丸中黃芩苷的含量測定方法。方法采用未涂層彈性融硅石英毛細管柱(60cm×75μm，有效長度52cm)，以40mmol·L-1硼砂溶液()為運行緩沖液;分離電壓為12kV;重力進樣10s(高度15cm);檢測波長為280nm;以對硝基苯甲酸為內(nèi)標。結(jié)果黃芩苷質(zhì)量濃度在～μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=6)，黃芩苷平均回收率為%，RSD值為%(n=6)。結(jié)論該方法專屬性強，結(jié)果準確可靠、重現(xiàn)性好，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】毛細管電泳法;梔子金花丸;黃芩苷

Abstract:ObjectiveToestablishthemethodforthedeterminationofbaicalininZhizijinhuapillsbycapillaryelectrophoresis.MethodsTheseparationwasperformedinanuncoatedfusedsilicacapillaryof60cm×75μmID(52cmeffectivelength).Therunningbufferwes40mmol·L-1Na2B4O7buffersolution().Thevoltageappliedwas12kV.Thesamplewasinjectedbygravity(10s，15cm).Thedetectionwavelengthwas280nm,andtheinternalstandardwaspnitrobenzoicacid.ResultsThelinearrangeofbaicalinwasμg·mL-1(r=6).Theaveragerecoveryforbaicalinwas%(RSD=%,n=6).ConclusionThemethodprovedtobeexclusive,convenient,rapidandwellrepeatable，andcanbeusedforquantitativedeterminationofZhizijinhuapills.

Keywords:capillaryelectrophoresis;Zhizijinhuapills;baicalin

梔子金花丸是由梔子、黃芩、黃連、黃柏等8味藥材制成的中藥成方制劑，具有清熱瀉火、涼血解毒之功效。用于肺胃熱盛，口舌生瘡，牙齦腫痛，目赤眩暈，咽喉腫痛，吐血衄血，大便秘結(jié)等的治療。梔子金花丸的現(xiàn)行標準采用HPLC法測定制劑中梔子苷的含量，亦有其他文獻報道采用HPLC法測定其中黃芩苷、梔子苷、綠原酸等成分的含量[2～6]，但采用毛細管電泳法對梔子金花丸進行質(zhì)量控制的方法尚未見報道。本文采用毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷的含量，為更好地控制梔子金花丸質(zhì)量提供了依據(jù)。

1儀器與試藥

儀器

CL1030型高效毛細管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)，KNAUERK2501紫外-可見檢測器(德國)，HW2000色譜站版(南京千譜有限公司)。ORIONMODEL828型pH計(美國)。DL360超聲波清洗器[寧波石浦海天電子儀器廠，頻率(±)kHZ，功率240W]。未涂層彈性融硅石英毛細管柱(河北銳年永灃色譜器件有限公司)。

試藥

黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200815)。梔子金花丸(山東孔圣堂制藥有限公司，批號090457、090546、090741，規(guī)格9g·袋-1)。甲醇為色譜純;硼砂、對硝基苯甲酸、NaOH均為分析純;水為雙蒸水。

2方法與結(jié)果

溶液的制備

內(nèi)標溶液的制備精密稱取對硝基苯甲酸適量，加水制成100μg·mL-1的內(nèi)標貯備液。

對照品貯備液的制備精密稱取在60℃減壓干燥4h的黃芩苷對照品15mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(黃芩苷質(zhì)量濃度為150μg·mL-1)。

供試品溶液的制備取梔子金花丸樣品，研碎，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分數(shù))甲醇50mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定重量，用70%(體積分數(shù))甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10mL至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再用70%(體積分數(shù))甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加入內(nèi)標溶液mL，用70%(體積分數(shù))甲醇稀釋至刻度，搖勻，μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

陰性對照液的制備取處方組成中除黃芩外的其余藥材，制成不含黃芩的陰性對照品，按“”項下方法處理，即得。

運行緩沖液的制備精密稱取硼砂適量，加水制成40mmol·L-1硼砂溶液(pH=)，μm微孔濾膜濾過，作為運行緩沖液。

電泳條件

采用未涂層彈性融硅石英毛細管柱(60cm×75μm，有效長度52cm);以40mmol·L-1硼砂溶液()為運行緩沖液;分離電壓為12kV;重力進樣10s(高度15cm);檢測波長為280nm;溫度為室溫，濕度小于70%。毛細管柱在使用前依次用mol·L-1NaOH溶液和水沖洗15～20min，再用運行緩沖液沖洗約5min。以對硝基苯甲酸為內(nèi)標。在此條件下進行測定，對照品、供試品、陰性對照溶液色譜見圖1。

方考察

標準曲線的制備分別吸取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為、、、、、、μg·mL-1，內(nèi)標物質(zhì)量濃度為μg·mL-1的溶液。依次重力進樣10s，每個濃度測定3次以上。以對照品與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=ρ-，r=6。表明黃芩苷在～μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗取質(zhì)量濃度為g·mL-1的黃芩苷對照品溶液，按“”項下電泳條件，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗取供試品溶液(批號090741)，在0、2、4、6、8、12h分別重力進樣10s，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗取同一批號(批號090741)的梔子金花丸樣品6份，按“”項下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為mg·g-1，RSD=%(n=6)。表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗精密稱取梔子金花丸樣品(批號090741)共6份，加入黃芩苷對照品適量，按“”項下方法處理并依法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。梔子金花丸中黃芩苷的平均回收率為%,RSD=%。表1加樣回收率試驗

樣品測定

取梔子金花丸樣品3批，按“”項下方法處理后依法測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。表2樣品含量測定

3討論

提取方法的選擇參考有關(guān)文獻[7，8]中黃芩苷的提取方法，本實驗先后以50%(體積分數(shù))甲醇、70%(體積分數(shù))甲醇、甲醇為溶劑進行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體積分數(shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時考察了不同提取時間(30、40、50min)對提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40min時提取率已達最高，超聲時間延長而提取率并未提高。因此，確定以70%(體積分數(shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

內(nèi)標物的選擇毛細管電泳有重現(xiàn)性差的缺點，因此采用內(nèi)標法定量。苯甲酸鈉、對氨基苯甲酸以及對硝基苯甲酸在280nm波長處均有吸收。預(yù)實驗結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時間與黃芩苷過于接近，容易產(chǎn)生干擾;對硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時間與黃芩苷接近，但在樣品中無干擾，故選其作為內(nèi)標物。

運行緩沖液的選擇黃芩苷極性較強，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團更易形成絡(luò)離子[10]，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運行緩沖液，并通過實驗確定其最佳濃度為40mmol·L-1。

采用毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比[1，5，6]具有樣品用量少，分析成本低等優(yōu)點，并減少了對的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

【參考文獻】

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[10]陳義.毛細管電泳技術(shù)及[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

方考察

標準曲線的制備分別吸取對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為、、、、、、μg·mL-1，內(nèi)標物質(zhì)量濃度為μg·mL-1的溶液。依次重力進樣10s，每個濃度測定3次以上。以對照品與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=ρ-，r=6。表明黃芩苷在～μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗取質(zhì)量濃度為g·mL-1的黃芩苷對照品溶液，按“”項下電泳條件，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗取供試品溶液(批號090741)，在0、2、4、6、8、12h分別重力進樣10s，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗取同一批號(批號090741)的梔子金花丸樣品6份，按“”項下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為mg·g-1，RSD=%(n=6)。表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗精密稱取梔子金花丸樣品(批號090741)共6份，加入黃芩苷對照品適量，按“”項下方法處理并依法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。梔子金花丸中黃芩苷的平均回收率為%,RSD=%。表1加樣回收率試驗

樣品測定

取梔子金花丸樣品3批，按“”項下方法處理后依法測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。表2樣品含量測定

3討論

提取方法的選擇參考有關(guān)文獻[7，8]中黃芩苷的提取方法，本實驗先后以50%(體積分數(shù))甲醇、70%(體積分數(shù))甲醇、甲醇為溶劑進行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體積分數(shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時考察了不同提取時間(30、40、50min)對提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40min時提取率已達最高，超聲時間延長而提取率并未提高。因此，確定以70%(體積分數(shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

內(nèi)標物的選擇毛細管電泳有重現(xiàn)性差的缺點，因此采用內(nèi)標法定量。苯甲酸鈉、對氨基苯甲酸以及對硝基苯甲酸在280nm波長處均有吸收。預(yù)實驗結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時間與黃芩苷過于接近，容易產(chǎn)生干擾;對硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時間與黃芩苷接近，但在樣品中無干擾，故選其作為內(nèi)標物。

運行緩沖液的選擇黃芩苷極性較強，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團更易形成絡(luò)離子[10]，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運行緩沖液，并通過實驗確定其最佳濃度為40mmol·L-1。

采用毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比[1，5，6]具有樣品用量少，分析成本低等優(yōu)點，并減少了對的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

【參考文獻】

國藥典委員會.中華人民共和國藥典：201