專題三：成體干細(xì)胞(前言和間充質(zhì)干細(xì)胞)

Ppt制作主題鮮明，重點(diǎn)突出，圖文一致

每張內(nèi)容不宜過多匯報(bào)語言儀態(tài)方式豐富，交流互動討論課總結(jié)成體干細(xì)胞——adultstemcell

在個(gè)體的發(fā)育過程：成體干細(xì)胞的概念

存在于成年個(gè)體的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力，已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，能夠自我更新并在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。成體干細(xì)胞的特性（1）極少量，特定區(qū)域（2）通常處于靜息狀態(tài)，分裂緩慢（3）自我更新與分化需要特定的微環(huán)境優(yōu)點(diǎn)分析

獲取相對容易自體成體干細(xì)胞避免了移植排斥理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險(xiǎn)很低倫理學(xué)爭議較少檢測方法

科學(xué)家尚未就成體干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致。經(jīng)常被采用的鑒定方法包括：

1)體內(nèi)示蹤法2)體外誘導(dǎo)分化移植的方法通過靜脈注射移植。通過椎管注射移植。通過介入方法直接移植到病變部位動脈血管。常見成體干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞角膜緣干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞皮膚干細(xì)胞腸上皮干細(xì)胞肝臟干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞

——mesenchymalstemcell

來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)。具有多向分化潛能，理想的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性形態(tài)特征細(xì)胞表面標(biāo)志

光學(xué)顯微鏡掃描電鏡圖1-8核質(zhì)比高，細(xì)胞器少的細(xì)胞×25000圖1-9核質(zhì)比較低，細(xì)胞器豐富的細(xì)胞×25000透射電鏡公認(rèn)的骨髓MSCs表面標(biāo)記：A:不表達(dá)分化相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志如脂多糖受體CD34以及白細(xì)胞表面抗原CD45等。B:但表達(dá)CD44、CD54、CD133、CD105、CD90等。間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)采集部位：髂骨上嵴、脛骨和股骨、胸骨和腰椎。分離方法：細(xì)胞帖壁篩選法

密度梯度離心法

細(xì)胞分子標(biāo)記分選法

細(xì)胞篩篩選法圖1第三代hBMMSCsHE染色×1000圖2hBMMSCsP1,P3,P5代生長曲線圖3hBMSCs成骨誘導(dǎo)第10天倒置相差顯微鏡×400圖7hBMSCs誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色×400圖4第3代hBMSCsCD29表達(dá)陽性×200圖5第3代hBMSCsCD90表達(dá)陽性×200圖6第3代hBMSCsCD166表達(dá)陽性×200間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化—成骨細(xì)胞

在MSCs培養(yǎng)體系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗壞血酸等單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的MSCs逐漸形成聚集體或結(jié)節(jié),堿性磷酸酶活性也隨之增高,基質(zhì)鈣化明顯,可分化為成骨細(xì)胞。

透明質(zhì)酸、骨形態(tài)形成蛋白-2(BMP-2)以及銅等均可促使MSCs向成骨細(xì)胞分化。

誘導(dǎo)分化—軟骨細(xì)胞（1）三維培養(yǎng)方式（2）無血清培養(yǎng)基（3）添加轉(zhuǎn)讓生長因子β家族成員在成人骨髓的MSCs培養(yǎng)體系中加入地塞米松和TGF-β3,在第14天時(shí),在細(xì)胞外基質(zhì)中檢測到Ⅱ型膠原；在含10-7moL/L地塞米松的培養(yǎng)基中培養(yǎng),有Ⅱ、Ⅹ型膠原表達(dá)。

誘導(dǎo)分化—脂肪細(xì)胞

用異丁基-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、胰島素和吲哚美辛（IM）聯(lián)合誘導(dǎo)人的MSCs,可觀察到細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集含脂質(zhì)豐富的小泡,多種誘導(dǎo)處理可使95%以上的細(xì)胞定向分化為脂肪細(xì)胞,并且細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)小泡不斷地長大、融合,最終充滿細(xì)胞。這些分化的脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)可健康生長至少3個(gè)月。誘導(dǎo)分化—心肌細(xì)胞

1體外分化實(shí)驗(yàn)小鼠股骨中獲得骨髓MSCs,經(jīng)5氮胞苷處理,大約30%的MSCs出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變,分化為類心肌細(xì)胞,并可重復(fù)檢測到自主起搏細(xì)胞。

（視頻）(1)分化的MSCs表達(dá)出特異性的心房利鈉肽(ANP)和腦利鈉肽(BNP)基因。表明分化的細(xì)胞含有類心肌收縮蛋白,完全不同于平滑肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞；(2)電鏡檢查類心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)時(shí)可觀察到:特征性的經(jīng)閏盤連接的肌節(jié)、中心核和心房顆粒；(3)5氮胞苷處理2～5周后，分化的MSCs電生理檢測到至少有2種完全不同的動作電位：2體內(nèi)分化由MSCs向類心肌細(xì)胞分化過程中,除5氮胞苷外,體內(nèi)心臟微環(huán)境對MSCs的分化也至關(guān)重要。Wang等在其實(shí)驗(yàn)中提及心肌微環(huán)境可以支持MSCs移植后的生長和向心肌細(xì)胞分化。

“環(huán)境依賴性分化”（milieu-dependentdifferentiation）內(nèi)容：認(rèn)為生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等以及它們在干細(xì)胞/宿主細(xì)胞之間的相互作用，在誘導(dǎo)MSCs向心肌分化方面起著重要作用。盡管MSCs向心肌分化的具體機(jī)制不清楚，但一致傾向認(rèn)為:組織損傷和高水平的多能細(xì)胞是其分化的兩個(gè)重要的決定因素。誘導(dǎo)分化—神經(jīng)細(xì)胞在丁化羥基苯甲醚(BHA)或β-巰基乙醇作用下,可誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化用雙丁酰環(huán)磷腺苷(dbcAMP)和異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)處理MSCs可誘導(dǎo)神經(jīng)分化早期標(biāo)記的表達(dá)在神經(jīng)生長培養(yǎng)基中添加EGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）同樣可誘導(dǎo)神經(jīng)分化早期標(biāo)記的表達(dá)。在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。誘導(dǎo)分化—內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多能成體祖細(xì)胞(multipotentadultprogenitorcells,MAPCs)是骨髓MSCs的一個(gè)亞群。2002年,首次在體外用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)把人骨髓MSCs誘導(dǎo)分化成具有脈管母細(xì)胞表型的細(xì)胞,隨后這些細(xì)胞分化成表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中MAPCs可以不斷擴(kuò)增80多個(gè)群體,倍增時(shí)間沒有明顯衰退表現(xiàn),所以在臨床治療方面,MAPCs是一種理想的內(nèi)皮細(xì)胞來源。牛垂體內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelialcellgrowthsupplementfrombovinepituitary,ECGS)國內(nèi)學(xué)者用牛垂體內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelialcellgrowthsupplementfrombovinepituitary,ECGS)對兔MSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，細(xì)胞80%融合時(shí)呈現(xiàn)“鋪路石