微生物 10-2、3第十章 微生物的遺傳變異和育種

第十章微生物的遺傳變異和育種

第二節(jié)基因突變與自然選育突變是工業(yè)微生物產(chǎn)生變種的根源，是育種的基礎(chǔ)，但也是菌種發(fā)生退化的主要原因。突變泛指微生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化?；蛲蛔兊奶攸c：自發(fā)性、不對應(yīng)性、稀有性、獨立性、可誘變性、穩(wěn)定性、可逆性。一、突變1.突變包含狹義的突變和廣義的突變。狹義的突變專指基因突變，也稱點突變，涉及一對或少數(shù)幾對核苷酸的增加、減少或取代。同義突變：突變后密碼子編碼的仍是同一種氨基酸；錯義突變：編碼另外一種氨基酸；無義突變：突變后為終止密碼；移碼突變：突變點后遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生移動。廣義的突變包括基因突變和染色體畸變。

染色體畸變指的是染色體結(jié)構(gòu)的改變，包括缺失、重復(fù)、倒位和易位等。2.突變包含自發(fā)突變和誘發(fā)突變。自發(fā)突變是在沒有采用誘變手段下野生菌群體中自然發(fā)生的突變體。誘發(fā)突變是采用物理或化學(xué)手段(即誘變劑)，處理后得到的突變體。自發(fā)突變和誘變本質(zhì)上是相同的，都是以一定的概率產(chǎn)生的。1.自然選育的概念自然選育：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變(SpontaneousMutation)而進(jìn)行的菌種篩選過程，又叫自然分離。二、自然選育自然突變的原因：（1）多因素低劑量的誘變效應(yīng)由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，如充斥空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的低濃度誘變物質(zhì)、微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)如H2O2等的作用。（2）互變異構(gòu)效應(yīng)胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)的第六位上可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)第六位可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)，平衡一般傾向于酮式和氨基式，但在偶然情況下，會出現(xiàn)稀有的烯醇式和亞氨基式，使DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中常出現(xiàn)的AT和GC堿基對變成GT和AC，發(fā)生突變，幾率約為10-8～10-9。2.自然選育的目的發(fā)酵工業(yè)使用的生產(chǎn)菌株，幾乎都是經(jīng)過人工誘變處理后獲得突變株，遺傳特性往往不夠穩(wěn)定，容易繼續(xù)發(fā)生變異，變異的方向一個是菌種衰退，造成發(fā)酵產(chǎn)量的降低，另一個是菌種變異獲得優(yōu)良性狀，使發(fā)酵產(chǎn)量提高。經(jīng)常進(jìn)行自然選育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存優(yōu)良的菌株，穩(wěn)定和提高發(fā)酵產(chǎn)量。

3.自然選育的一般程序：采用單菌落分離法單細(xì)胞或單孢子懸浮液要求有良好的分散度：細(xì)菌應(yīng)轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中培養(yǎng)，取得分散的菌體放線菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后在過濾,對粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散劑(如Tween80，一種非離子活性劑)4.自然選育的特點簡單易行；效率低、進(jìn)展慢、難以使生產(chǎn)水平大幅度提高，需要與誘變育種結(jié)合交替使用。第三節(jié)突變的誘發(fā)與微生物誘變育種

微生物育種過程分為三個階段：菌種基因型改變→→→篩選菌種，確認(rèn)并分離出具有目的基因型或表型的變異株→→→產(chǎn)量評估，全面考察變異株在工業(yè)化生產(chǎn)上的接受性。一、突變誘發(fā)過程從誘變劑進(jìn)入細(xì)胞到突變型出現(xiàn)的整個過程都會有一些因素影響突變的誘發(fā)。1誘變劑接觸DNA分子前2DNA損傷的修復(fù)五種修復(fù)方式：光復(fù)活作用；切補(bǔ)修復(fù)；重組修復(fù)；SOS修復(fù)系統(tǒng)；DNA多聚酶的校正作用。（D）SOS修復(fù)系統(tǒng)這是一種能夠造成誤差修復(fù)的“呼救信號”修復(fù)系統(tǒng)。當(dāng)DNA受到誘變劑損傷而阻斷DNA復(fù)制過程時，DNA損傷相當(dāng)于一個呼救信號，促使細(xì)胞中的有關(guān)酶系解除阻遏，而進(jìn)行DNA的修復(fù)。在修復(fù)過程中，DNA多聚酶在無模板的情況下進(jìn)行DNA的修復(fù)（E）DNA多聚酶的校正作用除了上述種種修復(fù)作用以外，細(xì)胞還具有對復(fù)制過程中出現(xiàn)的差錯加以校正的功能。大腸桿菌中的DNA復(fù)制依賴于三種DNA多聚酶的作用，這三種酶除了對于多核苷酸的多聚作用以外，還具有3′到5′核酸外切酶的作用。一般認(rèn)為依靠DNA多聚酶的這一作用，能在復(fù)制過程中隨時切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶發(fā)生突變而使其核酸外切酶活性減弱，那么它切除不正常核苷酸的能力減弱，菌體的突變率相應(yīng)地提高，成為增變突變型，DNA多聚酶為DNA修復(fù)作用所必需，所以增變突變型對于誘變劑的作用格外敏感。3從前突變到突變誘變劑造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變稱為前突變。前突變可以通過影響DNA復(fù)制而成為真正的突變，也可以經(jīng)過修復(fù)不發(fā)生突變。一般認(rèn)為光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù)和DNA多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突變的誘發(fā)，而重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng)具有引起差錯的性質(zhì)而有利于突變的發(fā)生。一切影響DNA修復(fù)系統(tǒng)中酶活性以及與突變相關(guān)的酶活性的因素都能影響由前突變向突變的轉(zhuǎn)變。例如：咖啡堿能抑制切補(bǔ)修復(fù)系統(tǒng)，從而增強(qiáng)誘變作用；SOS修復(fù)系統(tǒng)和重組修復(fù)依賴于蛋白質(zhì)合成，因而利于蛋白質(zhì)合成的因素有利于提高突變率；Ba2+（鋇）通過對DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性的抑制提高突變率。4從突變到突變型表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象稱為表型延遲。分離性延遲和生理性延遲分離性延遲：經(jīng)誘變后，細(xì)胞中野生型基因和突變型基因并存于同一細(xì)胞中，突變型基因由于屬于隱性基因而沒有表達(dá)，需要經(jīng)過復(fù)制、分離，在細(xì)胞中只有突變型基因，沒有野生型基因時，其性狀才得到表達(dá)。生理性延遲：在突變基因已經(jīng)為純的狀態(tài)后，突變表型還不一定出現(xiàn)，必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度才表現(xiàn)出來，而這些原有基因產(chǎn)物的濃度降低到能改變表型的臨界水平前，細(xì)胞已經(jīng)分裂多次，經(jīng)過多個世代。（如噬菌體菌株的表達(dá)會出現(xiàn)）二、誘變育種的方案設(shè)計誘變育種包括三個環(huán)節(jié)：突變的誘發(fā)、突變株的篩選、突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)，根據(jù)這三個環(huán)節(jié)進(jìn)行方案設(shè)計。

制定篩選目標(biāo)對于隨機(jī)出現(xiàn)的多種變異性狀，篩選的目標(biāo)除了要求高產(chǎn)量之外，還應(yīng)從生產(chǎn)的角度考慮其它有利性狀如：生長速度快、產(chǎn)孢子多；消除某些色素或無益組分等。但是所定的篩選目標(biāo)不可太多。工作量大，考慮實現(xiàn)目標(biāo)的可能性。誘變育種的步驟和方法包括：出發(fā)菌株的選擇，菌懸液的制備，誘變劑及誘變劑量的選擇，誘變的處理方式方法，純化分離等。三、誘變育種的步驟與方法（一）出發(fā)菌株出發(fā)菌株的選擇是決定誘變效果的重要環(huán)節(jié)。對菌種的遺傳背景、穩(wěn)定性、純一性以及形態(tài)、生理、生化等特性研究，都有利于提高誘變效果。2出發(fā)菌株的純化確定誘變出發(fā)菌株之后，就要進(jìn)行純化。純種分離方法，常用劃線分離法和稀釋分離法。采用顯微操縱儀分離單個孢子，培養(yǎng)形成單菌落，這樣可以得到完全真實的純菌株。稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法。基本過程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程涂布傾注梯度稀釋過程10-110-210-310-410-510-6（二）單孢子懸浮液的制備供