d1 緒論蛋白質(zhì)工程

酶與蛋白質(zhì)工程

陶鳳云taofengyun@126.com酶與蛋白質(zhì)工程考查課：24學(xué)時講課（1-12周），8學(xué)時上機(jī)（8,9周一下午6-9節(jié)615）成績構(gòu)成：1、平時（出勤，課堂表現(xiàn)，上機(jī)作業(yè)及報告、小測驗、期中考試等）70%2、期末考試30%作業(yè)1：蛋白質(zhì)（或酶、肽）結(jié)構(gòu)分析文獻(xiàn)綜述1、查文獻(xiàn)，選定蛋白（或酶、肽）登錄號或序列已知，研究背景，重要價值（應(yīng)用意義、科學(xué)理論價值），寫出文獻(xiàn)綜述，列出參考文獻(xiàn)。2、第3周交文獻(xiàn)綜述。作業(yè)2：抗菌肽（或蛋白質(zhì)、酶）分子改造（或分子設(shè)計）文獻(xiàn)綜述1、查文獻(xiàn)，選定肽序列已知，研究背景，意義，別人工作，優(yōu)點與不足，改造思路。寫出文獻(xiàn)綜述，列出參考文獻(xiàn)。2、第5周交文獻(xiàn)綜述。作業(yè)3：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析上機(jī)1、某一目標(biāo)序列分析（生物信息學(xué)分析）序列理化性質(zhì)（分子量，等電點，…）同源分子，序列比對，相似值，系統(tǒng)樹圖…PDB登錄號，三維結(jié)構(gòu)圖家族歸屬，組織分布等性質(zhì)2、寫出軟件或網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器網(wǎng)址，用法。3、分析越全面，軟件或服務(wù)器功能使用越多，成績越高，可獨立完成，也可2-4人一組合作（明確寫出分工）。4、最遲第8周上機(jī)完成，上機(jī)時操作檢查。交報告打印版及電子版。作業(yè)4：抗菌肽分子改造上機(jī)1、序列理化性質(zhì)分析：分子量，等電點，氨基酸組成…功能相關(guān)結(jié)構(gòu)分析：二級結(jié)構(gòu)：螺旋，折疊，跨膜，…

分子改造比較分子改造前、后，相關(guān)序列理化性質(zhì)、功能相關(guān)結(jié)構(gòu)差別2、寫出軟件或網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器網(wǎng)址，用法，列出參考文獻(xiàn)。3、分析越全面，軟件或服務(wù)器功能使用越多，成績越高，可獨立完成，也可2-4人一組合作（明確寫出分工）。4、最遲第9周上機(jī)完成，上機(jī)時操作檢查。交報告打印版及電子版。一、酶與蛋白質(zhì)工程的簡介定義蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，利用基因工程技術(shù)對現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造，組建新型蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。

目的：生產(chǎn)性能比自然界存在的天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的蛋白質(zhì)新品種。 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)識——基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的體外重組表達(dá)技術(shù)——手段2門課程合并為1門基因工程是遵循中心法則

DNA→mRNA→蛋白質(zhì)→折疊產(chǎn)生功能

基本上是生產(chǎn)出自然界已有的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是按照以下思路進(jìn)行的：確定蛋白質(zhì)的功能→蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級結(jié)構(gòu)→蛋白質(zhì)應(yīng)具備的折疊狀態(tài)→應(yīng)有的氨基酸序列→應(yīng)有的堿基排列可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的基本途徑及其現(xiàn)有天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)形成過程的比較二、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能2、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能設(shè)計和預(yù)測3、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能每一種蛋白質(zhì)有自己獨特的氨基酸順序，蛋白質(zhì)功能部位的幾個氨基酸殘基決定著蛋白質(zhì)的功能，必須處于一個及其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。只要能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的必需氨基酸及空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學(xué)活性就會保持不變。改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能通過改變氨基酸達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。2、蛋白質(zhì)分子改造“大改”，設(shè)計自然界不存在的全新蛋白質(zhì)?！靶「摹保簬讉€殘基的替換；“中改”：大規(guī)模地肽鏈或結(jié)構(gòu)域替換；不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；

通過物理、化學(xué)法修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)、水解肽鏈等； 生物化學(xué)法利用蛋白酶選擇性分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)等3、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾1、蛋白質(zhì)工程的發(fā)展簡史1982年，Winter等首次報道通過基因定點誘變獲得改性酪氨酸t(yī)RNA合成酶。1983年，Ulmer在《Science》上發(fā)表了ProteinEngineering的專論，標(biāo)志著蛋白質(zhì)工程的正式誕生。1982年~1985年，F(xiàn)orsht等對酪氨酰tRNA合成酶的分子進(jìn)行了改造，根據(jù)X射線衍射實測該酶與底物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)，通過定點突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的aa殘基，還用動力學(xué)方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機(jī)制，這就是最早的蛋白質(zhì)工程。三、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展1984年，Perry通過將溶菌酶中Ile3改成Cys3，并進(jìn)一步氧化成Cys3-Cys97二硫鍵，提高了酶的熱穩(wěn)定性，顯著改進(jìn)了溶菌酶在食品工業(yè)的應(yīng)用價值。1987年，F(xiàn)orsht將枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而導(dǎo)致活性中心His64質(zhì)子pKa從7降到6，使酶在pH=6時的活力提高10倍。工業(yè)用酶最佳pH的改變預(yù)示著其可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。三、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展1988年，杜邦公司成功設(shè)計合成了由四段反平行

-螺旋組成為73個氨基酸殘基?！ㄟ^從頭設(shè)計，折疊成新蛋白質(zhì)的目標(biāo)是可以實現(xiàn)的。四、蛋白質(zhì)工程研究的主要技術(shù)（一）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù) 生物信息學(xué)分析技術(shù) 定點突變等遺傳操作技術(shù)（二）、蛋白質(zhì)分離純化舉例通過蛋白質(zhì)工程來提高重組β-干擾素專一活性和穩(wěn)定性。

人的干擾素的cDNA大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)抗病毒活性為106U/mg天然產(chǎn)品的十分之一抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。β-干擾素蛋白質(zhì)中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位）干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形式存在。?推測：不正確的二硫鍵將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸問題分析原因解決結(jié)果（一）蛋白質(zhì)工程在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1）提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性如葡萄糖異構(gòu)酶（GI）突變型比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高10-12℃；酶比活相同2）融合蛋白質(zhì)

化學(xué)合成的腦啡肽（Enk）N端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人α1型干擾素IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)這一融合蛋白，融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN六、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用3）蛋白質(zhì)活性的改變