酶-生化試驗報告

生物大分子?酶相關(guān)生化實驗報告小組成員：王書洋張斌賈官斐楊翀左天宇單位：武警后勤學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系四隊四班郵編：300162關(guān)鍵詞淀粉酶;活性;溫度;抑制劑;激活劑;專一性【前言】目前臨床主要以檢測指標作為依據(jù)對疾病的診斷作出較為準確的判斷。其中，酶學(xué)上的應(yīng)用占了相當一部分。所以，從臨床疾病診斷以及治療的角度去對酶學(xué)知識的具體化了解和應(yīng)用深化是十分有必要的。酶是高效催化有機體新陳代謝各步反應(yīng)的活性蛋白，幾乎所有的生化反應(yīng)都離不開酶的催化。因此，一切對蛋白質(zhì)活性有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性，受溫度、pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。對酶活性的測定對臨床診斷以及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究都有著重要意義。很多酶其實包含幾種具有同樣催化效用的蛋白質(zhì)，但它們的分子組成、理化性質(zhì)與免疫學(xué)特性卻有明顯差異，這類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為該酶的同工酶。同工酶在組織和器官中的分布不同，通過測定不同同工酶的含量與活性的變化，可以推算出改組織和器官的變化。本綜述旨在對后文的三次實驗作為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的一次應(yīng)用上的聯(lián)系。實驗一影響酶促反應(yīng)速度的因素【實驗原理】唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各種糊精和麥芽糖。淀粉溶液與碘反應(yīng)呈藍色；糊精根據(jù)分子大小，與碘反應(yīng)分別呈藍、紫、紅、無色等不同的顏色；麥芽糖不與碘呈色。唾液淀粉酶的活性受溫度、酸堿度、抑制劑與激活劑等的影響。溫度：溫度降低，酶促反應(yīng)減弱或停止；溫度升高，反應(yīng)速度加快。當上升至某一溫度時，酶促反應(yīng)速度達最大值，此溫度稱為酶的最適溫度。由于酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，因此如果溫度繼續(xù)升高，反應(yīng)速度反而會迅速下降甚至完全喪失。酸堿度：唾液淀粉酶最適pH為pH6.9,高于或低于酶的最適pH值，都將引起酶活性的降低，過酸或過堿的反應(yīng)條件可使酶活性喪失。抑制劑與激活劑：酶的活性常受某些物質(zhì)的影響，能增加酶的活性稱為酶的激活劑：降低酶活性且不使酶蛋白變性的稱為酶的抑制劑。如Cl-為唾液淀粉酶的激活劑，CU2+為唾液淀粉酶的抑制劑。根據(jù)上述性質(zhì)，可以用碘檢查淀粉是否水解及其水解程度，間接判斷唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。標本】唾液【測定方法】試劑：1％淀粉溶液，1％氯化鈉溶液，1％硫酸銅溶液，1％硫酸鈉溶液，碘液，磷酸氫二鈉(0.2mmol/L),檸檬酸溶液(O.lmmol/L)。器材：試管，試管夾，恒溫水浴鍋(37°C),吸管，滴管，試管架，操作：1?收集唾液：實驗者先將痰咳盡，用自來水漱口，清除口腔內(nèi)食物殘渣，再含蒸餾水約15mL,作咀嚼咕漱運動,3min后吐入墊有兩層經(jīng)潤濕處理的脫脂紗布的漏斗內(nèi),過濾氣泡及食物殘渣后于小燒杯中備用。觀察溫度對酶促反應(yīng)速度的影響取試管3支，編號1，2，3，按下表操作：試劑(ml)123①唾液111②1%淀粉222①①水浴5min100C(冷卻)37C0C①①混合水浴5min100C37C0C碘液1滴(冷卻)1滴1滴3.觀察pH對酶促反應(yīng)速度的影響(1)配制一系列pH不等的緩沖液。試劑(ml)1230.2mmol/L磷酸氫二鈉5.157.729.720.1mmol/L檸檬酸4.852.280.28pH5.006.808.00(2)取試管3支，編號1,2,3，按下表操作:試劑(ml)123唾液222緩沖液3(pH5.00)3(pH6.80)3(pH8.00)1%淀粉22237C水浴10min碘液1滴1滴1滴4觀察激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響取試管4支，編號1,2,3,4，按下表操作：試劑滴12341%淀粉20202020唾液10101010蒸餾水6——————1%氯化鈉——6————1%硫酸銅————6——1%硫酸鈉——————637C水浴5—10min碘液1滴1滴1滴1滴【結(jié)果及討論】溫度對酶促反應(yīng)的影響：此組實驗的三個試管模擬人體的環(huán)境即近中性,通過觀察不同溫度下酶活性強弱,證明溫度對酶活性有很大影響。1號試管的顏色變化比較大,無色時淀粉被完全分解為單糖,晴褐色時淀粉不完全分解,藍色時淀粉完全沒被分解,淺藍色時少許被分解；也就是說不同人的唾液淀粉酶活性在ioo°c時受影響的程度不同，有的被完全抑制，有的部分受影響，而有的和在37c時相比幾乎無變化。號試管無色，說明淀粉完全被分解為單糖，不能與碘發(fā)生顏色反應(yīng)；通觀3號試管發(fā)現(xiàn)唾液淀粉酶活性在0C時大都被抑制，或是完全被抑制或是大部分被抑制。pH值對酶促反應(yīng)的影響：此組實驗在37C下設(shè)置三個pH值：5.0（酸性）、6.8（近中性）和8.0（堿性）。通過各個試管的顏色判斷酶活性強弱。酶活性比較強時，淀粉完全分解，顯示無色或碘液的淺黃色;號試管顏色相近，酶活性比較弱時，淀粉不能被完全分解，依被分解的程度不同顯示不同的顏色。相比較1均為晴褐色，說明其中的淀粉被分解為多糖，也就是淀粉酶在酸性環(huán)境中能發(fā)揮作用;而在3號試管的堿性環(huán)境中，淀粉酶發(fā)揮作用的強弱程度不同，有的能將淀粉部分分解，顏色呈現(xiàn)棕而言，2號試管的顏色最淺，說明37C時酶活性最強，淀粉被完全分解。黃色，有的不能分解，呈深藍色。激活劑和抑制劑對酶活性的影響：在37C、近中性環(huán)境中，設(shè)置對照（蒸餾水）、0.9%NaCl、1%CuSO4、1%Na2SO4的四組實驗，通過觀察顏色，判斷酶活性強弱，從而得出抑制劑和激活劑。對照組中酶將淀粉完全分解，加碘液呈無色，2、4號顏色與1號相近，說明其中的淀粉被完全分解，因此0.9%NaCl、1%Na2SO4為激活劑，3號試管為深藍色，說明其中的淀粉沒有被分解，酶不能發(fā)揮其應(yīng)有的作用，可以判斷1%CuSO4為抑制劑?！究偨Y(jié)】通過實驗發(fā)現(xiàn)唾液淀粉酶具有高度專一性，其活性受溫度、pH值、激活劑及抑制劑等多種因素影響;每個人產(chǎn)生唾液淀粉酶的量不同，活性強弱也有差異。不同人的酶活性受環(huán)境條件影響程度也不同，有些人的酶活性在一定條件下幾乎不受影響，而有些幾乎失活。人體唾液淀粉酶在37C活性最強，但0C、100C下酶活性并沒有完全喪失，而是活性受到影響，特別是0C時酶活性受影響比較大，其活性比較弱，由此可知很多水果、蔬菜中的酶在低溫時活性比較低，有利于保鮮。同時發(fā)現(xiàn)中性環(huán)境中淀粉酶活性最強，不同來源的酶對堿的耐受度不同，有的影響不大，有的幾乎失活。稀釋的唾液，由于酶濃度降低，其活性也相應(yīng)降低，出現(xiàn)相應(yīng)的顏色反應(yīng)。臨床意義】（待補）實驗二血清乳酸脫氫酶的測定（比色法）【實驗原理】乳酸脫氫酶在有輔酶I攜氧的情況下，使乳酸脫氫酶生成丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸苯肼。苯肼在堿性溶液中顯紅棕色，其顯色的深淺與丙酮酸的濃度成正比。440nm下與同樣處理的丙酮酸標準液進行比色，求得乳酸脫氫酶的活力單位?！緲吮尽啃迈r兔肝【材料與方法】器材：紫外分光光度儀，加樣槍，容量瓶，滴管，試管等。試劑：0.1mol甘氨酸溶液稱取甘氨酸7.505g，氯化鈉5.85g,蒸餾水溶解后稀釋到1000ml。pH10.0乳酸鈉緩沖底物液吸取70%乳酸鈉溶液10ml、0.1ml甘氨酸溶液125ml、0.1N氫氧化鈉75ml，混合，加氯仿數(shù)滴防腐，置冰箱保存。輔酶I溶液稱取輔酶I10mg,加蒸餾水2ml，溶解后置冰箱保存，約可用6周。2,4-二硝基苯肼溶液 稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10NHCL10ml溶解后，加蒸餾水至100ml，置棕色瓶內(nèi)，置冰箱保存。0.4N氫氧化鈉溶液。丙酮酸標準液（1pmol/L） 準確稱取純丙酮酸鈉11.0mg，置于100ml容量瓶中，加入乳酸鈉緩沖底物液使其溶解并稀釋至刻度。此液應(yīng)新鮮配制。操作：先將血清標本做1/5稀釋（血清1份蒸餾水4份），然后按照表進行操作。試劑ml測定對照稀釋血清（1/5）0.10.1乳酸鈉緩沖底物液1.01.037°C水浴預(yù)溫3min輔酶I溶液0.20蒸餾水00.2混勻，置37C水浴箱保溫15min2,4-二硝基苯肼1.00.1混勻，置37C水浴箱保溫15min0.4N氫氧化鈉溶液1010混勻，室溫放15min，用440nm或藍色濾光板進行比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度讀數(shù)，以測定管吸光度減去對照管吸光度，于標準曲線上查其活力單位值。［標準曲線繪制］血清乳酸脫氫酶比色測定法標準曲線繪制操作步驟加入物管號0123456丙酮酸標準液（1|Jmol/L）0.050.10.20.30.40.5乳酸鈉緩沖底物液1.00.950.90.80.70.60.5蒸憎水0.30.30.30.30.30.30.32,4-二硝基苯月井1.01.01.01.01.01.01.0置37C水浴箱保溫15min0.4N氫氧化鈉溶液10.010.010.010.010.010.010.0相當乳酸脫氫酶單位02505001000150020002500混勻，室溫放5min,用440nm或藍色濾光板進行比色，以蒸憎水調(diào)零，讀取各管吸光度讀數(shù)，以各管吸光度減去0號管讀數(shù)(縱坐標)后，與其相應(yīng)的酶活力單位值(橫坐標)在坐標紙上作圖，繪成曲線。［注］以100ml標本在37°C與底物作用15min,生成1“mol丙酮酸為1個乳酸脫氫酶活力單位?！居懻摗俊就卣埂垦迦樗崦摎涿秆迦樗崦摎涿附榻B：乳酸脫氫酶(LDH或LD)是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，可催化丙酮酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應(yīng)，也可催化相關(guān)的a-酮酸。LDH廣泛存在于人體組織中，以心、腎、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺組織次之。LDH測定方法主要有比色法和連續(xù)監(jiān)測法。血清乳酸脫氫酶正常值：比色法：150?450U/L。連續(xù)監(jiān)測法：男80?280U/L女100?230U/L血清乳酸脫氫酶臨床意義：LDH測定常用診斷心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤。心肌梗死：發(fā)病10?12h升高，24?48h達高峰，8?9天后恢復(fù)正常。與CK相比，雖然酶活性出現(xiàn)較遲，陽性率較低，但持續(xù)時間長，且活性增高的程度與心肌梗死的病情密切相關(guān)，梗死范圍越大，其酶活性越高。若LDH增高后恢復(fù)遲緩，或在病程中再次增高，提示梗死范圍擴大，預(yù)后不良。肝臟疾病:急性肝炎或慢性活動性肝炎LDH常顯著或中度升高。其敏感度略低于ALT。肝癌時LDH活性明顯升高，尤其是轉(zhuǎn)移性肝癌增高更顯著?？蛇_1000U/L。血液?。喊籽?、巨幼紅細胞貧血、惡性淋巴瘤等LDH活性升高。其他：營養(yǎng)不良、橫紋肌損傷、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也升高【相關(guān)資料】實驗三瓊脂糖凝膠電泳法分離乳酸脫氫酶同工酶【生化特性】【材料與方法】標本:新鮮兔肝器材：電泳法，試管，加樣槍，載玻片，滴管，吸量管，恒溫水浴箱等。試劑：1.巴比妥-鹽酸緩沖液(pH8.4,0.1mol/L)：溶17.0g巴比妥鈉于600ml蒸憎水，加入1mol/L鹽酸溶液23.5ml，再加蒸餾水于1000mL。0.5mol/L乳酸鈉溶液：稱取5.6g乳酸鈉溶于蒸餾水并稀釋至100ml。1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉稱取EDTANa?^0372mg,溶解于蒸餾水中，并定容至l00ml。0.5%緩沖瓊脂糖凝膠:溶0.05g瓊脂糖于5ml(pH8.4,0.1mol/L)的巴比妥一鹽酸緩沖液中，加蒸餾水5ml再加入EDTANa2溶液0.2ml冰箱保存?zhèn)溆谩?.8-0.9%瓊脂糖染色膠：溶80-90mg瓊脂糖于5ml(pH8.4,0.1mol/L)的巴比妥一鹽酸緩沖液中，再加入0.001mol/LEDTANa2溶液0.2ml，冰箱保存?zhèn)溆?。顯色液：溶50mgNBT于20ml蒸餾水(25ml棕色容量瓶)溶解后加入NAD+125mg及PMS12.5mg，加蒸餾水25ml，避光低溫保存，一周內(nèi)有效，如溶液呈綠色即失效。7.2%醋酸緩沖液：2ml醋酸(99.5%)加蒸餾水98ml。8.電泳緩沖液(pH8.6,0.075mol/L)：稱取巴比妥鈉15.45g、巴比妥2.76g溶蒸餾水并稀釋至1000ml。材料兔肝勻漿制備：處死家兔，立即將其肝臟取出，用蒸餾水洗凈，稱重后剪碎，按照1g加4ml蒸餾水之比例加蒸餾水后，置勻漿器中勻漿十五分鐘。提取勻漿上清液：將兔肝勻漿四層紗布過濾，濾液離心(400rad/s)15分鐘共兩次，取上清液，冰箱保存?zhèn)溆?。操?.瓊脂糖凝膠板的制備和電泳：將0.5%瓊脂糖凝膠水浴熔化。取2ml熔化的凝膠液平澆于一潔凈載玻片上。凝膠凝固后，于凝膠板一段1/3處用一硬紙片插入(不插透凝膠)過一會將紙片拔出即可獲一小槽。用毛細管向小槽內(nèi)加入新鮮兔肝勻漿約10ul，將凝膠板加入電泳槽內(nèi)，兩端各以浸有電泳液的紗布作鹽橋，點樣端靠近陰極電泳，電壓保持100V，電泳40—60min。顯色：電泳終止前約10min左右，將0.8~0.9%瓊脂糖染色膠在水浴中熔化，取此膠0.67ml與