多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究進(jìn)展

多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究進(jìn)展

二聚乙醇是一種具有獨(dú)特理化性質(zhì)的大型聚合物。它具有良好的滲透性，可與二氯甲烷、n'二甲胺、苯、乙腈和乙醇等有機(jī)溶劑混合。二聚乙醇是由環(huán)氧乙烷聚合而成的。根據(jù)反應(yīng)條件，平均劑量從數(shù)百到數(shù)十萬(wàn)之間收集。普通的聚乙二醇分子兩端都有一個(gè)羥基。如果一端用甲基密封，則獲得聚乙二醇單烷基（mpeg）的異構(gòu)甲基結(jié)合物。在計(jì)算氨基酸和蛋白質(zhì)聚乙二醇（peg）的過(guò)程中，使用最多的是mpeg衍生物。PEG:HO—(CH2CH2O)n—CH2CH2—OHmPEG:CH3O—(CH2CH2O)n—CH2CH2—OH蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究始于二十世紀(jì)七十年代,最初的目的主要是為了降低蛋白質(zhì)類藥物的免疫原性.進(jìn)一步的研究表明,蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾后還可以改善許多其它方面的性質(zhì),如增加蛋白質(zhì)對(duì)酶的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)蛋白質(zhì)在血漿中的半衰期、增加在水中的溶解度等.一些蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾物在作為藥物的應(yīng)用中取得了較好的效果.1991年,第一種經(jīng)聚乙二醇化修飾的蛋白質(zhì)類藥物PEG-腺苷脫氨酶被FDA批準(zhǔn)上市,用于治療一種嚴(yán)重的兒童免疫缺陷癥.2001年,用聚乙二醇修飾的干擾素(PEG-INTRON)經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,用于治療慢性丙型肝炎.多肽與蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)上具有許多相似之處,肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究,近年來(lái)關(guān)于肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究也取得了一些進(jìn)展,尤其是肽類化合物在聚乙二醇化定點(diǎn)修飾方面較蛋白類物質(zhì)更易于實(shí)現(xiàn),因此開(kāi)展肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究也具有較重要的意義.在多肽的聚乙二醇化修飾研究中應(yīng)用最普遍的是mPEG,先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基團(tuán),或者制備經(jīng)mPEG修飾的氨基酸衍生物,再利用固相或液相法將其偶聯(lián)到肽序列中去,實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N端,C端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾.下面主要介紹近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化定點(diǎn)修飾的一些方法.1氨基酸的控制在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法中,主要是對(duì)N末端或賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行酰化修飾.因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)中通常存在多個(gè)氨基,所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度一直是蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中的一個(gè)難點(diǎn).肽類化合物的合成中可以通過(guò)采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)策略來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基的定點(diǎn)修飾.1.1聚乙二醇mpeg的合成為了實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中氨基的聚乙二醇化?；揎?需要在聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年,Lu等首先報(bào)道了在固相多肽合成中應(yīng)用單甲氧基聚乙二醇的羧基衍生物對(duì)肽鏈的N端氨基進(jìn)行酰化修飾的方法:以mPEG作原料,先合成mPEG—OCH2COOH和mPEG—OCH2CO—Nle—OH,在mPEG中引入一個(gè)正亮氨酸(Nle)作為標(biāo)記是為了便于確定每一個(gè)多肽分子上偶聯(lián)了幾個(gè)mPEG分子.應(yīng)用Fmoc固相多肽合成法,先在樹(shù)脂上合成全保護(hù)肽鏈,當(dāng)游離出N末端氨基后,以BOP作縮合劑,將mPEG—OCH2CO—Nle—OH作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈上,然后經(jīng)三氟乙酸裂解和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化得到了平均分子量分別為2000和5000的mPEG修飾N-端的4肽、8肽和12肽,mPEG修飾產(chǎn)物在RP-HPLC分析圖譜上呈單一峰,結(jié)構(gòu)經(jīng)MALDT-TOF-MS分析得到確證.研究還表明,聚乙二醇對(duì)三氟乙酸處理穩(wěn)定,但氟化氫處理時(shí)會(huì)有部分?jǐn)嗔?故此法不適用于Boc固相多肽合成法(Eq.1).雖然mPEG—OH與琥珀酸酐反應(yīng)可以很容易地得到mPEG—OCOCH2CH2COOH,但此分子中含有對(duì)酸和堿都不太穩(wěn)定的酯鍵,不適合用于固相多肽合成中.若通過(guò)mPEG—NH2與琥珀酸酐反應(yīng)引入羧基得到mPEG—NHCO～CH2CH2COOH,此類分子具有較好的穩(wěn)定性,適用于固相多肽合成中.mPEG—NH2可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)商品化試劑獲得,也可以由mPEG—OH作原料合成.在mPEG—OCH2COOH的合成中應(yīng)用了丁基鋰,反應(yīng)需在絕對(duì)無(wú)水條件下進(jìn)行,而mPEG—NHCOCH2CH2COOH的合成比較容易些(Scheme1).Lee等以平均分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亞胺(SC-mPEG)在弱堿性水溶液中(pH=8)修飾鮭降鈣素(sCT),經(jīng)RP-HPLC分離得到N端、Lys11和Lys18側(cè)鏈氨基分別被聚乙二醇?；揎椀娜N產(chǎn)物,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)酶解和質(zhì)譜分析得到確證,它們?cè)诖笫竽I臟勻漿中的半衰期分別為125.5,157.3和281.5min,比sCT在大鼠腎臟勻漿中的半衰期(4.8min)顯著增加.用相同的方法,Lee等以平均分子量為3400的SC-mPEG對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)進(jìn)行修飾,經(jīng)RP-HPLC分離到N端、Lys28和Lys48側(cè)鏈氨基分別被聚乙二醇?；揎椀娜N產(chǎn)物.生物活性測(cè)定表明,N端修飾產(chǎn)物活性高于Lys28和Lys48側(cè)鏈修飾產(chǎn)物.SC-mPEG及其類似物在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中應(yīng)用較多,反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn),一般在弱堿性的水溶液中進(jìn)行.控制蛋白質(zhì)和SC-mPEG的比例可以得到單聚乙二醇化修飾的產(chǎn)物,產(chǎn)物的純化方法也比較簡(jiǎn)便,可用透析、電泳及凝膠色譜等常用方法實(shí)現(xiàn).由于SC-mPEG對(duì)游離氨基沒(méi)有選擇性,當(dāng)有多個(gè)氨基時(shí),往往難以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的聚乙二醇化修飾,分析和確定產(chǎn)物中聚乙二醇的修飾位點(diǎn)也較難(Eq.2).1.2特定氨基酸側(cè)鏈氨基的聚乙二醇化Lu等報(bào)道以mPEG羧基衍生物修飾賴氨酸側(cè)鏈氨基得到Fmoc-Lys(mPEG—OCH2CO)—OH,在固相多肽合成中將其作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈中去,實(shí)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基的聚乙二醇化修飾.也可以在固相合成過(guò)中用烯丙氧羰基(Alloc)保護(hù)特定位置的賴氨酸側(cè)鏈氨基,肽鏈組裝完畢后先脫除Alloc,再將mPEG—OCH2COOH偶聯(lián)到賴氨酸側(cè)鏈氨基上去.然后經(jīng)三氟乙酸裂解、RP-HPLC純化可得到對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行聚乙二醇化修飾的產(chǎn)物.此法適用于Fmoc固相多肽合成法中對(duì)賴氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme2).1.3烷基化反應(yīng)Kinstler等用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG—CHO)修飾rhG-CSF.反應(yīng)在pH為5.0的水溶液中進(jìn)行,活潑的醛基可將聚乙二醇偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子的氨基上,同時(shí)以氰基硼氫化鈉作為還原劑實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的烷基化修飾.此法具有較好的選擇性,主要是修飾蛋白質(zhì)的N末端氨基.其溫和的反應(yīng)條件適用于固相或液相多肽合成,此法若應(yīng)用于多肽的N端氨基修飾可能也會(huì)取得較好的效果(Eq.3).2肽鏈c末端羧基的修飾Lu等以mPEG—NH2作原料修飾天冬氨酸側(cè)鏈羧基得到Fmoc-Asp(mPEG—NH)—OH,將其用到固相多肽合成中實(shí)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)肽鏈中天冬氨酸側(cè)鏈羧基的修飾.也可以在合成過(guò)程中用烯丙基(Allyl)保護(hù)特定位置的天冬氨酸側(cè)鏈羧基,肽鏈組裝完畢后在固相上先脫除Allyl,再將mPEG—NH2偶聯(lián)到天冬氨酸側(cè)鏈羧基上,實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中特定天冬氨酸側(cè)鏈羧基的聚乙二醇修飾.此法適用于Fmoc固相多肽合成法中對(duì)天冬氨酸或谷氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme3).在固相多肽合成中,若先將Fmoc—NH—PEG—COOH偶聯(lián)到樹(shù)脂上,再合成肽鏈,最后用三氟乙酸裂解,可以實(shí)現(xiàn)肽鏈C末端羧基的聚乙二醇化修飾.3用半胱氨酸溶液作為催化劑Campbell等在生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)類似物的C端引入半胱氨酸,在mPEG上引入巰基吡啶,然后通過(guò)二硫鍵交換實(shí)現(xiàn)mPEG對(duì)GRF類似物C端的修飾(Eq.4).Vanwetsswinkel等用定點(diǎn)突變法在蛋白質(zhì)中引入半胱氨酸,以mPEG-MAL作為聚乙二醇化試劑,通過(guò)蛋白質(zhì)上的巰基加成到mPEG-MAL的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾,此法已在許多蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中取得了良好的效果.mPEG-MAL可通過(guò)商品化試劑買(mǎi)到,也可以用mPEG—NH2為原料合成.若在肽鏈中引入半胱氨酸,也可以實(shí)現(xiàn)此類反應(yīng)(Scheme4).4sc-mpeg-谷氨酰胺側(cè)鏈的選擇性修飾近年來(lái),蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法發(fā)展很快,為多肽的聚乙二醇化修飾提供了不少新思路.Wylie等通過(guò)控制pH值實(shí)現(xiàn)SC-mPEG選擇性修飾蛋白質(zhì)中的組氨酸側(cè)鏈的咪唑基.Sato用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)將mPEG-NH2轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的谷氨酰胺側(cè)鏈上,實(shí)現(xiàn)對(duì)谷氨酰胺的選擇性修飾.借鑒這些方法,也有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中組氨酸和谷氨酰胺側(cè)鏈的選擇性聚乙二醇化修飾(Eq.5).5聚乙二醇化修飾隨著蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾技術(shù)的迅速發(fā)展,肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究越來(lái)越引人注目.蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾幾乎都在水溶液中進(jìn)行,通過(guò)選擇合適的聚乙二醇化試劑或控制反應(yīng)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)、定量修飾.肽類化合物的聚乙二醇化修飾可在固相載體上進(jìn)行,此法易于實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽鏈中某位點(diǎn)的選擇性修飾,但固相合成反應(yīng)速度慢,且隨著聚乙二醇或多肽分子量增加,修飾難度增大;肽類化合物的聚乙二醇化修飾也可以在水溶液中進(jìn)行,可以實(shí)現(xiàn)分子